ky体育在线登陆常見問題的原因分析和處理方法（1）

　酶聯免疫吸咐試驗（ELISA）具有靈敏度高、特異性好的特點，廣泛應用於(yu) 各種傳(chuan) 染性疾病的篩查，如肝炎、HIV，也可應用優(you) 生優(you) 育等。的試劑、良好的儀(yi) 器和正確的操作是保證ELISA實驗結果準確、可靠的必要條件。試驗中若不做好相關(guan) 控製，易出現白板、花板、色弱和假陽性等現象。尤其是花板現象（空白、陰性、陽性對照以及室內(nei) 質控孔結果正常，而標本孔的OD值卻明顯偏高）是各級研究實驗室常遇到的問題。現將ELISA實驗操作中的影響因素總結如下： 
　　1標本因素 
　　以辣根過氧化物酶（HRP）為(wei) 標記的ELISA測定中，殘留在孔內(nei) 的血紅蛋白具有過氧化物酶樣活性，催化底物顯色造成假陽性；混有紅細胞的血清易沉澱或附著在聚乙烯孔內(nei) 不易洗淨；如有細菌汙染，菌體(ti) 中可能含有內(nei) 源性HRP，也會(hui) 產(chan) 生假陽性反應；標本凝固不全，在研究試驗中，有時為(wei) 了爭(zheng) 取時間而快速檢測，常在血液還未開始凝固時即強行離心分離血清，使血清中仍殘留部分纖維蛋白原，在ELISA測定過程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊，易造成假陽性結果；采血試管洗滌不*、反複使用易交叉汙染；塑料試管能吸附抗原物質，樣本久置在塑料管內(nei) 會(hui) 使樣本內(nei) 抗原含量下降造成假陰性。 
　　因此血清標本宜在新鮮時檢測，禁用嚴(yan) 重溶血的標本。一般說來，在5 d內(nei) 測定的血清標本可放置於(yu) 2～8℃，標本在冰箱中保存時間過長易導致血清IgG聚合，使間接法的試劑本底加深。超過1周測定的需-20℃保存。凍結血清融解後，蛋白質局部濃縮，分布不均，應充分混勻並避免產(chan) 生氣泡。混濁或有沉澱的血清標本應先離心或過濾，澄清後再檢測。反複凍融會(hui) 使抗體(ti) 效價(jia) 跌落，所以測抗體(ti) 的血清標本如需保存做多次檢測，宜少量分裝冰存；使用一次性玻璃試管或真空采血管；並使用非抗凝標本，肝素抗凝血漿會(hui) 增加OD值，可能與(yu) 高濃度肝素具有強大的負電荷，能吸附酶標記物，不易洗脫有關(guan) ；EDTA、酶抑製劑（如NaN3）可抑製ELISA係統中辣根過氧化物酶活性；血液標本采集後必須使其充分凝固後再分離血清，或標本采集時用帶分離膠或一次性真空促凝采血管。 
　　2試劑因素 
　　ELISA診斷試劑經曆了從(cong) 合成肽向基因工程抗原的過渡。由於(yu) 曆史的原因，人們(men) 往往以反應本底的好壞來衡量ELISA反應試劑盒。因此，有些廠家為(wei) 了保持較好的本底而采用了單片段基因工程抗原及合成肽包被，該類試劑盒的流行病學敏感度不夠，穩定性也成問題。也有廠家堅持試劑盒高的流行病學敏感度，科學地對待反應結果。基因工程抗原較合成肽抗原有無抗原決(jue) 定簇的肽片段；第二代產(chan) 品包被的抗原既有基因工作抗原又有合成肽，隻是當時的基因工程抗原不全，僅(jin) 包括了HCV的核心區片段；第三代產(chan) 品基本上采用了基因工程抗原，而且這些抗原包括更多、更穩定、純度更高的HCV特異性抗菌素原。第三代試劑的敏感度大大提高了。基因工程抗原與(yu) 合成肽抗原的區別如下： 
　　基因工程抗原是抗菌素原基因在質粒載體(ti) 中原核或真核表達的蛋白質抗原，多以大腸杆菌或酵母為(wei) 表達係統。該類抗原與(yu) 合成肽相比具有以下特點。①分子量大。合成肽采用化學方法製備，由於(yu) 工藝的局限，合成數量有限，隻能達到數百個(ge) 氨基酸；而利用基因工程製備的抗菌素原，分子量更大。②穩定性好。包被抗原的穩定性決(jue) 定試劑盒的有效期，早期以合成肽為(wei) 包裝抗原的試劑盒有效期隻有3～4個(ge) 月，改作基因工程抗原後有效期大大延長了。③基因工程抗原將特異性抗原決(jue) 定簇基因融合表達，表達產(chan) 物包含更多的抗原決(jue) 定簇，可提高試劑盒的靈敏度，提高檢出率。④純化難度大。基因工程抗原的純化技術難度較大。合成多肽抗原是根據蛋白質抗原分子的某一抗原決(jue) 定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。合成肽抗原有以下特點：分子量太小；一般隻含有一個(ge) 抗原決(jue) 定簇；純度高；穩定性差。 
　　國內(nei) 酶聯免疫試劑廠家較多；不同廠家出產(chan) 的試劑靈敏度與(yu) 特異性存在一定的差別，資料顯示，不同廠家試劑的特異性和敏感性分別為(wei) 89.4%，99.3%，78%，89%，存在較大差異。有的廠家酶標板孔間A值差大於(yu) 15%；標記酶的活性及顯色液的穩定比較差。使用劣質的試劑必然導致結果的假陽性或假陰性。因此，選擇高質量的試劑是保證結果準確的關(guan) 鍵之一。 
　　選擇試劑時應選擇靈敏度高、特異性好、穩定性好、批間差異小、操作方便、省時的優(you) 良檢測試劑，國家參比實驗室每年對各廠家的試劑進行質量評估並定期評估結果，可作為(wei) 選擇試劑的主要依據； 要注意試劑的批號和出廠日期，雖然試劑的有效期多為(wei) 1年。選擇剛出廠的試劑使用；不同廠家的試劑不能混用。 
　　不同方法學的檢測試劑會(hui) 使乙肝兩(liang) 對半結果出現一些不同。例如：在實際工作中，常用ELISA檢測HBsAg結果為(wei) 陰性，而電化學發光檢測為(wei) 陽性。除方法學的靈敏度外，還存在使用單抗或多克隆抗體(ti) 試劑的區別。。