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一、酶免疫技術的分類

　　酶免疫技術是以酶標記的抗體(ti) 或抗原為(wei) 主要試劑的方法，是標記免疫技術的一種。免疫技術是利用抗原抗體(ti) 反應進行的檢測方法，即應用製備好的特異性抗原或抗體(ti) 作為(wei) 試劑，以檢測標本中的相應抗體(ti) 或抗原。它的特點是具有高度的特異性和敏感性。如將抗原或抗體(ti) 用可以微量檢測的標記物（例如放射性核素、熒光素、酶等）進行標記，則在與(yu) 標本中的相應抗體(ti) 或抗原反應後，可以不必測定抗原抗體(ti) 複合物本身，而測定複合物中的標記物，通過標記物的放大作用，進一步提高了免疫技術的敏感性。這種標記免疫技術一般分為(wei) 兩(liang) 類，一類用於(yu) 組織切片或其他標本中抗原或抗體(ti) 的定位；另一類用於(yu) 液體(ti) 標本中抗原或抗體(ti) 的測定。前者屬於(yu) 免疫組化技術範疇，後者則稱為(wei) 免疫測定。

　　酶免疫測定根據抗原抗體(ti) 反應後是否需要分離結合的與(yu) 遊離的酶標記物而分為(wei) 均相和異相兩(liang) 種類型，實際上所有的標記免疫測定均可分成這兩(liang) 類。以標記抗體(ti) 檢測標本中的抗原為(wei) 例，按照簡單的形式是在試劑抗體(ti) 過量的情況下進行，其反應式如下：

Ab*+ Ag——Ab*Ag+Ab*

　　Ab*Ag代表結合的標記物， Ab*為(wei) 遊離的標記物。如在抗原反應後，先把Ab*Ag與(yu) Ab* 分離；然後測定Ab*Ag或Ab*中的標記物的量，從(cong) 而推算出標本中的抗原量，這種方法稱為(wei) 異相法。如在抗原抗體(ti) 反應後Ab*Ag中的標記物* 失去其特性，例如酶失去其活力，熒光物質不顯熒光，則不需要進行Ab*Ag 與(yu) Ab*的分離，可以直接測定遊離的Ab* 量，從(cong) 而推算出標本中的Ag含量，這種方法稱為(wei) 均相法。

　　在異相法中，抗原和抗體(ti) 如在液體(ti) 中反應，分離遊離和結合的標記物的方法有許多種。與(yu) 放射免疫測定相類似的液相異相酶免疫技測定，在某些激素等定量測定中也有應用。但常用的酶免疫測定法為(wei) 固相酶免疫測定。其特點是將抗原或抗體(ti) 製成固相製劑，這樣在與(yu) 標本中抗體(ti) 或抗原反應後，隻需經過固相的洗滌，就可以達到抗原抗體(ti) 複合物與(yu) 其他物質的分離，大大簡化了操作步驟。這種被稱為(wei) EL1SA 的檢測技術成為(wei) 目前研究檢驗中應用較廣的免疫測定方法。

二、方法類型和操作步驟

　　ELISA可用於(yu) 測定抗原，也可用於(yu) 測定抗體(ti) 。在這種測定方法中有3種必要的試劑：① 固相的抗原或抗體(ti) ，② 酶標記的抗原或抗體(ti) ，③ 酶作用的底物，根據試劑的來源和標本的性狀以及檢測的條件，可設計出各種不同類型的檢測方法。

　　（一）雙抗體(ti) 夾心法：

　　雙抗體(ti) 夾心法是檢測抗原zui常用的方法，操作步驟如下：

　　（1）將特異性抗體(ti) 與(yu) 固相載體(ti) 連接，形成固相抗體(ti) ：洗滌除去未結合的抗體(ti) 及雜質。

　　（2）加受檢標本：使之與(yu) 固相抗體(ti) 接觸反應一段時間，讓標本中的抗原與(yu) 同相載體(ti) 上的抗體(ti) 結合，形成固相抗原複合物。洗滌除去其他未結合的物質。

　　（3）加酶標抗體(ti) ：使同相免疫複合物上的抗原與(yu) 酶標抗體(ti) 結合。*洗滌未結合的酶標抗體(ti) 。此時固相載體(ti) 上帶有的酶量與(yu) 標本中受檢物質的量正相關(guan) 。

　　（4）加底物：酶催化底物成為(wei) 有色產(chan) 物。根據顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量。
根據同樣原理，將大分子抗原分別製備固相抗原和酶標抗原結合物，即可雙抗原夾心法測定標本中的抗體(ti) 。

　　（二）雙位點一步法：

　　在雙抗體(ti) 夾心法測定抗原時，如應用針對抗原分子上兩(liang) 個(ge) 不同抗原決(jue) 定簇的單克隆抗體(ti) 分別作為(wei) 固相抗體(ti) 和酶標抗體(ti) ，則在測定時可使標本的加入和酶標抗體(ti) 的加入兩(liang) 步並作一步。這種雙位點一步法不但簡化了操作，縮短了反應時間，如果使用高親(qin) 和力的單克隆抗體(ti) ，測定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體(ti) 的應用使測定抗原的ELISA提高到新水平。

　　在一步法測定中，應注意鉤狀效應，類同於(yu) 沉澱反應中抗原過剩的後滯現象。當標本中待測抗原濃度相當高時，過量抗原分別和固相抗體(ti) 及酶標抗體(ti) 結合，而不再形成夾心複合物，所得結果將低於(yu) 實際含量。鉤狀效應嚴(yan) 重時甚至可出現假陰性結果。

　　（三）間接法測抗體(ti) ：

　　間接法是檢測抗體(ti) 時zui常用的方法，其原理為(wei) 利用酶標記的抗-抗體(ti) 檢測已與(yu) 固相結合的受檢抗體(ti) 。故稱為(wei) 間接法。操作步驟如下：

　　（1）將特異性抗原與(yu) 固相載體(ti) 連接，形成固相抗原。洗滌除去未結合的抗原及雜質。

　　（2）加稀釋的受檢血清：其中的特異抗體(ti) 與(yu) 抗原結合，形成固相抗原抗體(ti) 複合物。經洗滌後，固相載體(ti) 上隻留下特異性抗體(ti) 。其他免疫球蛋白及血清中的雜質由於(yu) 不能與(yu) 固相抗原結合，在洗滌過程中被洗去。

　　（3）加酶標抗抗體(ti) ：與(yu) 固相複合物中的抗體(ti) 結合，從(cong) 而使該抗體(ti) 間接地標記上酶。洗滌後，固相載體(ti) 上的酶量就代表特異性抗體(ti) 的量。例如： 欲測人對某種疾病的抗體(ti) ，可用酶標羊抗人lgG抗體(ti) 。

　　（4）加底物顯色：顏色深度代表標本中受檢抗體(ti) 的量。本法隻要更換不同的固相抗原，可以用一種酶標抗抗體(ti) 檢測各種與(yu) 抗原相應的抗體(ti) 。

　　（四）競爭(zheng) 法：

　　競爭(zheng) 法可用於(yu) 測定抗原，也可用於(yu) 測定抗體(ti) 。以測定抗原為(wei) 例，受檢抗原和酶標抗原競爭(zheng) 與(yu) 同相抗體(ti) 結合，因此結合於(yu) 固相的酶標抗原量與(yu) 受檢抗原的量呈反比。操作步驟如下：

　　（1）將特異抗體(ti) 與(yu) 固相載體(ti) 連接，形成固相抗體(ti) ，洗滌。

　　（2）待測管中加受檢標本和一定量酶標抗原的混合溶液，使之與(yu) 固相抗體(ti) 反應。如受檢標本中無抗原，則酶標抗原能順利地與(yu) 固相抗體(ti) 結合。如受檢標本中含有抗原，則與(yu) 酶標抗原以同樣的機會(hui) 與(yu) 固相抗體(ti) 結合，競爭(zheng) 性地占去了酶標抗原與(yu) 固相載體(ti) 結合的機會(hui) ，使酶標抗原與(yu) 固相載體(ti) 的結合量減少。參考管中隻加酶標抗原，保溫後，酶標抗原與(yu) 同相抗體(ti) 的結合可達zui充分的量。洗滌。

　　（3）加底物顯色：參考管中由於(yu) 結合的酶標抗原zui多，故顏色zui深，參考管顏色深度與(yu) 待測管顏色深度之差，代表受檢標本抗原的量。待測管顏色越淡，表於(yu) 標本中抗原含量越多。

　　（五）捕獲法測lgM抗體(ti)

　　血清中針對某些抗原的特異性lgM常和特異性lgG伺時存在，後者會(hui) 幹擾lgM抗體(ti) 的測定。因此測定lgM抗體(ti) 多用捕獲法。先將所有血清lgM（包括異性lgM和非特異性lgM）固定在固相上，在除去lgG後再測定特異性lgM。

　　操作步驟如下：

　　（1）將抗人lgM抗體(ti) 連接在固相載體(ti) 上，形成固相抗人lgM。

　　（2）加入稀釋的血清標本：保溫反應後血清中的lgM 抗體(ti) 被固相抗體(ti) 捕獲。洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質成分。

　　（3）加入特異性抗原試劑：它隻與(yu) 固相上的特異性lgM 結合。

　　（4）加入針對特異性的酶標抗體(ti) ，使之與(yu) 結合在固相上的抗原反應結合。

　　（5）加底物顯色：如有顏色顯示，則表示血清標本中的特異性lgM抗體(ti) 存在，為(wei) 陽性反應。

　　（六）親(qin) 和素和生物素的ELlSA親(qin) 和素是一種糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每個(ge) 分子由4個(ge) 亞(ya) 基組成，可以和4 個(ge) 生物素分子親(qin) 密結合。現在使用更多的是從(cong) 鏈黴菌中提取的鏈黴和素（strepavidin）。生物素（biotin）又稱維生素H，分子量244.31，存在於(yu) 蛋黃中。用化學方法製成的衍生物，生物素一羥基玻璃亞(ya) 胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可與(yu) 蛋白質、糖類和酶等多種類型的大小分子形成生物素化的產(chan) 物。親(qin) 和素與(yu) 生物素的結合，雖不屬免疫反應，但特異性強，親(qin) 和力大，兩(liang) 者一經結合就極為(wei) 穩定。由於(yu) 1個(ge) 親(qin) 和素分子有4個(ge) 生物素分子的結合位置，可以連接更多的生物素化的分子，形成一種類似晶格的複合體(ti) 。因此把親(qin) 和素和生物素與(yu) ELIS偶聯起來，就可大大提高檢測的靈敏度。

　　親(qin) 和素——生物素係統在ELISA中的應用有多種形式，可用於(yu) 間接包被，亦可用於(yu) 終反應放大。可以在同相上先預包被親(qin) 和素，原用吸附法包被固相的抗體(ti) 或抗原生物素結合，通過親(qin) 和素——生物素反應而使生物素化的抗體(ti) 或抗原固相化，這種包被法不僅(jin) 可增加吸附的抗體(ti) 或抗原量，而且使其結合點充分暴露。另外，在常規ISA中的酶標抗體(ti) 也可用生物素化的抗體(ti) 替代，然後連接親(qin) 和素——酶結合物，以放大反應信號。