蛋白AG瓊脂糖凝膠

 蛋白AG瓊脂糖凝膠

英文名稱：Protein AG-Berpharose FF

貨號：B2836

規格：5ml

產(chan) 品介紹

蛋白A蛋白G瓊脂糖凝膠FF是將重組蛋白A蛋白G融合蛋白鍵合在瓊脂糖凝膠微球上形成的親(qin) 和分離介質。同單獨的蛋白A或蛋白G分離介質相比，具有更寬廣的結合範圍，同時融合後的r-PAG降低了對pH值的依賴，允許在pH5-8進行結合。本產(chan) 品多用於(yu) 免疫沉澱(IP)以及免疫共沉澱(Co-IP)研究，及抗體(ti) 固定及其它相關(guan) 研究。

規格

1ml（預裝柱）、5ml（預裝柱）、10ml（預裝柱）、25ml、100ml、500ml 純化流程

以免疫共沉澱（Co-IP）舉(ju) 例：

結合緩衝(chong) 液：20mM磷酸緩衝(chong) 液、150mMNaCl、pH7.0

洗脫緩衝(chong) 液：0.1M甘-氨酸，PH3.0

中和緩衝(chong) 液：1 M Tris-HCl，pH 8.5

（注：所用過柱液體(ti) 在使用之前建議用至少小於(yu) 等於(yu) 0.45μm濾膜過濾）

（1）樣品預處理：細胞、植物、動物組織裂解液樣品，最終總蛋白濃度選擇在0.5-1.0ug/ul範圍內(nei) 為(wei) 宜，上樣前要確保樣品溶液擁有合適的離子強度和pH值（如：可以用結合緩衝(chong) 液對樣品液進行稀釋或透析）；哺乳動物細胞內(nei) 有多種成分可以和IgG發生結合，可能會(hui) 在後續免疫印跡中出現非特異性條帶，可通過加入Normal IgG和Protein AG-Berpharose FF的方式預處理裂解液樣品，以降低非特異性結合。

（2）抗原-抗體(ti) 複合物製備：將抗體(ti) 與(yu) 含有目的蛋白的裂解液混合，室溫震蕩孵育30-60min（或4-8度孵育過夜），形成抗原-抗體(ti) 複合物（可根據已優(you) 化好的抗原抗體(ti) 結合條件處理）。

（注意：抗體(ti) 的加入量要依據填料量，抗體(ti) 的加入量過多會(hui) 影響到抗原-抗體(ti) 混合物與(yu) 填料的結合，故建議抗體(ti) 加入量為(wei) 填料載量的80%）

（3）填料平衡：取適量的Protein AG Berpharose FF加入到2ml離心管中，500 r離心1min，棄上清，加入0.5ml結合緩衝(chong) 液，懸浮填料，500 r離心1min，棄上清，重複兩(liang) 次。

（4）抗原-抗體(ti) 複合物的吸附：將抗原-抗體(ti) 複合物加入到平衡好的填料中，均勻，在室溫下置於(yu) 翻轉混合儀(yi) 或者手工輕輕翻轉離心管，促使樣品和填料充分接觸並吸附，約30min後，500 r離心1min，取上清液，留樣檢測。

（5）除雜清洗：向上述離心管中加入0.5ml的結合緩衝(chong) 液，懸浮填料，進行清洗，500 r離心1min，吸棄上清，重複兩(liang) 次。

（6）抗原洗脫：

①非變性洗脫法（洗脫的樣品保持原有的生物活性，可用於(yu) 後期功能分析）：向離心管中加入5倍柱體(ti) 積的洗脫緩衝(chong) 液，用移液器吹打5次，混勻，然後在室溫下置於(yu) 翻轉混合儀(yi) 或者手工輕輕翻轉離心管10min後，500 r離心1min，吸取上清液，收集洗脫組分，即為(wei) 目標抗原，收集上清液至新的離心管中，並立即加入十分之一體(ti) 積的中和緩衝(chong) 液中和緩衝(chong) 液調節其pH至中性，用於(yu) 後期功能分析。

     ②變性洗脫法（洗脫的樣品適用於(yu) SDS-PAGE檢測）：向離心管中加入25ul  1×SDS-PAGE Loading Buffer混合均        勻，95℃加熱5min。然後進行離心，200 r離心1min，收集上清液，進行SDS-PAGE電泳，轉膜後進行Western分析。

  蛋白AG瓊脂糖凝膠