鎳瓊脂糖凝膠

鎳瓊脂糖凝膠

英文名稱：Ni-Berpharose FF

貨號：B2824

規格：1ml

1.      產(chan) 品介紹

鎳-瓊脂糖凝膠FF以瓊脂糖微球為(wei) 基質，活化偶聯亞(ya) 氨基二乙酸（IDA），之後螯合Ni2+。IDA是金屬螯合層析中最-常用的配體(ti) ，和次氮基三乙酸（NTA）相比，IDA具有親(qin) 和力強、載量高、可再生重複使用等優(you) 點。

鎳-瓊脂糖凝膠FF主要用於(yu) 純化含有組-氨酸標簽（His-Tag）的重組蛋白。組-氨酸標簽中的咪唑環同過渡金屬Ni2+形成穩定的配位鍵，能特異、牢固和可逆地吸附在固定有Ni2+的基質上，可通過增加咪唑濃度對重組蛋白進行競爭(zheng) 洗脫。

2.規格

1ml（預裝柱）、5ml（預裝柱）、10ml（預裝柱）、20ml、100ml、500ml 純化流程

①平衡

鎳-瓊脂糖凝膠FF柱用2~5個(ge) 柱體(ti) 積的初始緩衝(chong) 溶液進行平衡。

建議流速為(wei) 100 cm/h。

②上樣

（1）樣品一般溶解於(yu) pH6~8的初始緩衝(chong) 液中。提高上樣緩衝(chong) 液的pH值可以增大載量。

（2）緩衝(chong) 液中不能含有EDTA和檸檬酸鹽，同時最好避免巰基乙醇、DTT等還原劑。

（3）常用緩衝(chong) 液有10~100 mM磷酸鈉緩衝(chong) 液、20~200 mM Tris-HCl緩衝(chong) 液等。

（4）緩衝(chong) 液中一般要加入0.15~0.5 M的NaCl以消除離子交換作用。

（5）初次使用鎳-瓊脂糖凝膠FF時，推薦使用50 mM PBS（50 mM NaH2PO4，0.5 M NaCl,pH 7.4）作為(wei) 初始緩衝(chong) 液。

③洗脫

（1）增加咪唑濃度進行洗脫是鎳-瓊脂糖凝膠FF最-常用的洗脫方法。

（2）咪唑為(wei) 堿性，相應緩衝(chong) 液配製後需要用HCl調節pH值。

（3）初次使用鎳-瓊脂糖凝膠FF時，如不確定洗脫需要的咪唑濃度，推薦在初始緩衝(chong) 液中分別加入10 mM、20 mM、50 mM、100 mM、200 mM、500 mM咪唑，濃度從(cong) 低

到高分別洗脫和收集重組蛋白，之後通過SDS-PAGE電泳等方法鑒定洗脫結果。

（4）有條件的可以進行咪唑梯度線性洗脫以確定較佳的洗脫條件。

洗脫方法

（1）降低pH洗脫：大多數蛋白在pH6~4會(hui) 被洗脫下來（也可以在pH 3~4），緩衝(chong) 液可以是醋酸鈉、檸檬酸和磷酸鹽緩衝(chong) 體(ti) 係。

（2）競爭(zheng) 性洗脫：線性增加或一步增加同金屬離子有親(qin) 和力的競爭(zheng) 物質的濃度（如0~0.5M咪唑、0~50 mM組-氨酸、0~2M NH4Cl）。梯度洗脫最好在起始緩衝(chong) 液的恒定pH值下進行。

（3）螯合劑洗脫：EDTA、EGTA等螯合劑可同金屬離子產(chan) 生作用力，導致蛋白被洗脫下來。此法不能分離不同的蛋白，還會(hui) 影響蛋白的吸附，導致融合蛋白無法掛柱。

注：降低pH洗脫和螯合劑洗脫會(hui) 使得金屬離子脫落，下次使用前需要重新螯和金屬離子。最-常用的方法為(wei) 競爭(zheng) 性洗脫。

上述洗脫方法，均須在緩衝(chong) 液中加入150 ~500mM的NaCl以消除離子交換作用。

5.再生、清洗、保存

①凝膠再生

（1）多次使用後或需要更換螯合的金屬離子時，必須將凝膠脫鎳再生。脫鎳方法：用5~10個(ge) 柱體(ti) 積的蒸餾水淋洗柱子，再用5~10個(ge) 柱體(ti) 積的100 mM EDTA淋洗柱子，最後用2~3個(ge) 柱體(ti) 積的0.5 M NaCl洗掉殘留的EDTA。

（2）多次使用的柱子脫鎳後一般需要進行清洗。清洗方法：用0.1~1.0 M NaOH反向清洗柱子，50 cm/h保持1~2 h，能去除結合強的雜質，同時也能去除熱源。

（3）清洗後需要重新螯合金屬離子。螯合方法：用2~5個(ge) 柱體(ti) 積的蒸餾水充分平衡脫鎳後的柱子，用0.1~0.3 M金屬鹽溶液過柱5~10個(ge) 柱體(ti) 積以螯合金屬離子，之後用5~10個(ge) 柱體(ti) 積的蒸餾水淋洗以去除未螯合的金屬離子。

②在位清洗

（1）去除因離子交換作用吸附的蛋白：2~3個(ge) 柱體(ti) 積的2 M NaCl溶液反向清洗。

（2）去除強疏水性蛋白和脂質等：4個(ge) 柱體(ti) 積的70%乙醇或者30%異丙醇反向清洗。

（3）除去蛋白沉澱、疏水性蛋白：參照凝膠再生步驟。

6.注意事項：

1)使用時保證柱子和緩衝(chong) 液的溫度一致，避免柱床內(nei) 產(chan) 生氣泡，影響純化效果。

2)本產(chan) 品保存條件為(wei) 20%乙醇，4~8℃。

3) 2-25℃,常壓,避光運輸

4）僅(jin) 供科研實驗使用

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