免疫組化實驗代測服務

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免疫組化是應用免疫學基本原理——抗原抗體(ti) 反應，即抗原與(yu) 抗體(ti) 特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體(ti) 的顯色劑 (熒光素、酶、金屬離子、同位素) 顯色來確定組織細胞內(nei) 抗原(多肽蛋白質)，對其進行定位、定性及定量的研究，稱為(wei) 免疫組織化學技術(immunohistochemistry)或免疫細胞化學技術(immunocytochemistry)。

免疫組化（IHC）技術通過計分法或灰度計量法也可以反應抗原的表達量，但其特點在於(yu) 切片製作過程中保持組織、細胞的原有結構及形態，因此可以反應目標抗原在組織結構中的分布以及亞(ya) 細胞定位。組織細胞定位往往是生理功能發揮或變化的體(ti) 現，是研究中常常關(guan) 注的因素。

免疫組化實驗說明：

1、免疫組化要做預實驗。

3、拍照倍數分100倍，200倍，400倍。正常情況下拍照是200倍3張，400倍3張。

4、全景掃描可看任意倍數。

免疫組化主要步驟:
1.洗載玻片: 將載玻片置於(yu) 重鉻酸鉀和濃H2SO4混合液中,目的是為(wei) 了是載玻片上的矽膠等除去,同時使一些肉眼看不見的凹凸不平的表麵變平整,便於(yu) 組織吸附,然後置於(yu) 清水中清洗,除去殘餘(yu) 的重鉻酸鉀和濃H2SO4(大約衝(chong) 一個(ge) 小時左右),再將載玻片浸泡於(yu) 酒精之中, 然後放到架子上,置於(yu) 37°C溫箱中，將多聚賴氨酸塗布於(yu) 玻片的表麵，由於(yu) Lys帶正電，而大多數的組織帶負電荷，從(cong) 而產(chan) 生吸附作用。

2.包埋組織: 先在鐵模具中加入一些液態石蠟，先稍微冷卻，然後再將待包埋的組織置於(yu) 石蠟之中，並排列整齊，再將塑料模具盒蓋上，後加入少許液體(ti) 石蠟，進行冷凍，使石蠟變成固態。

3.切片：將包埋好的組織從(cong) 模具上取下來，並置於(yu) 石蠟切片機上，切片機通過調節上下左右來來使組織和切割方向*，然後調節切片的厚度，一般為(wei) 5µm,如果比較難切，則可以適當調整厚度，用毛筆將切割的載玻片向外拉，並用小鑷子將包含有完整組織的載玻片置於(yu) 40°C溫水中。

4.撈組織：當組織載玻片置於(yu) 40°C溫水中之前，要先將水浴中的氣泡趕走，以免氣泡受熱上浮而貼到組織上，組織受熱展開，醉好是組織不起皺紋，用載玻片撈組織時，一般取載玻片的下1/3或者下1/2一般每種組織撈5-6張，其中2-3張是備用的，每張載玻片上通常撈兩(liang) 份組織，做對照使用，這樣形成的誤差就比較小了，而且撈載玻片的時候醉好方向*，以便觀察，再將撈出來的載玻片置於(yu) 架子上，放入37°C溫箱中烘幹。

5.脫蠟：依次將載玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精，起脫蠟作用的主要是二甲苯,依據的是相似相溶的原理.一般在每個(ge) 試劑中放10min,天氣熱可以少放幾分鍾,相反,天氣較冷的話,就要適當延長脫蠟時間,一般為(wei) 12-15min.

6.抗原修複：脫蠟後在清水中衝(chong) 洗一段時間，加入3%H2O2浸泡10min，從(cong) 而除去內(nei) 源性的過氧化氫酶，然後倒掉H2O2，在清水中洗兩(liang) 次，再加入檸檬酸緩衝(chong) 液，放入微波爐中蒸煮3min（中火），一般剛到沸騰即可，冷卻至室溫，然後再蒸煮一次，冷卻至室溫，蒸煮的目的是為(wei) 了使抗原的位點暴露出來。

7.血清封閉：冷卻至室溫後，將檸檬酸緩衝(chong) 液倒掉，水洗2次，並將載玻片置於(yu) PBS中5min，洗2次，擦幹組織周圍的PBS液，馬上加上血清，使一些非特異性的位點封閉起來，然後放入37°C溫箱中半小時。血清稀釋10倍（900µlPBS：100µl血清封閉液）。

8.加一抗：將溫箱中的載玻片取出，用吸水紙擦幹載玻片反麵和正麵組織周圍的血清，加一抗，如果做對照實驗，就在對照的組織上加PBS。加完一抗後於(yu) 4°C冰箱中保存過夜。

9.加二抗：將載玻片從(cong) 冰箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦幹組織周圍的PBS後加上二抗,然後置於(yu) 37°C溫箱中半小時。

10.加SABC: 將片子從(cong) 溫箱中取出, 放入PBS中洗3次，每次5min，擦幹組織周圍的PBS後加上SABC, 然後置於(yu) 37°C溫箱中半小時。SABC稀釋100倍（990µlPBS：10µlSABC）。

11.加顯色劑: 將片子從(cong) 溫箱中取出, 放入PBS中洗3次，每次5min，擦幹組織周圍的PBS後加上顯色劑。（顯色劑的配置：在1ml水中加1滴顯色劑A，搖勻，然後加1滴顯色劑B，搖勻，再加1滴顯色劑C，搖勻）   A：DAB        B：H2O2        C：磷酸緩衝(chong) 液

12.複染: 將顯色後的片子用清水衝(chong) 洗一段時間後，浸泡於(yu) 蘇木精中染色，一般動物組織為(wei) 半分鍾，植物組織3-5min。

13.脫水：將複染後的片子置於(yu) 水中衝(chong) 洗後，依次將載玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。每個(ge) 試劑中放置2min，後浸泡在二甲苯中，搬到通風櫃中。

14.封片：用中性樹膠滴在組織旁邊，再用蓋玻片蓋上，要先放平一側(ce) ，然後輕輕放下另一側(ce) ，以免產(chan) 生氣泡，封好片子後置於(yu) 通風櫃中晾幹。
免疫組化的相關(guan) 試劑：重要的是選擇好一抗、二抗或者還有三抗，注意抗體(ti) 的特異性、效價(jia) 和交叉反應。

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