基質金屬蛋白酶(mmp2/9)試劑盒

所有產(chan) 品僅(jin) 供科研使用，不能用於(yu) 食用和醫療等

基質金屬蛋白酶(mmp2/9)試劑盒描述：基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)以無活性的酶原形式分泌，活化後能夠降解 細胞外基質的膠原蛋白，又稱膠原酶。通過影響細胞外基質，膠原酶參與(yu) 胚胎發育、形態發生、組 織重塑等過程，並參與(yu) 炎症、腫瘤、心血管、神經等許多疾病過程。血漿與(yu) 組織中的 MMP-2、MMP-9 參與(yu) 各種生理與(yu) 病理過程，其在研究診斷和治療中的意義(yi) 日益受到重視。

本試劑盒采用酶譜法(zymography)檢測 MMP-2、MMP-9  活性。Zymography  是一種廣為(wei) 使用的、基 於(yu) SDS-PAGE 電泳和反相凝膠染色的蛋白酶檢測方法，其靈敏度可達 1 nM，高於(yu) ELISA 方法 2，其 基 本原理和程序是：製備加有膠原酶底物的 SDS-PAGE 凝膠，含蛋白酶的樣品在此凝膠中進行電 泳， 電泳結束後取出凝膠與(yu) 酶反應 Buffer 孵育，凝膠染色與(yu) 脫色。凝膠中由於(yu) 含底物蛋白而被深 染，形 成深色背景，但在有蛋白酶條帶的位置，蛋白酶將降解凝膠中的底物蛋白，因而不被染色 而形成透 亮區域，從(cong) 而能同時指示 MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。本試劑盒提供MMP-2、MMP-9 特異蛋白底物及酶學反應緩衝(chong) 液，可檢測少至 0.1~0.5 µl 血液中的 MMP-2、MMP- 9 酶譜及活性，檢 測靈敏度~1 nM。試劑盒可進行 50 次標準小膠檢測，如果小膠加樣孔為(wei) 10~15個(ge) ，則總計可檢測 500~750 個(ge) 樣品。

基質金屬蛋白酶(mmp2/9)試劑盒適用: 檢測 MMP-2、MMP-9 酶譜及活性（Detect MMP2 and MMP9 as low as 1 nM）。

組成與(yu) 儲(chu) 存 (50 assays)：

1.2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 1.5 ml µl, 20 ºC；
2.10 × Substrate G, 50 ml, 20 ºC；
3. 10 × Buffer A, 50 ml, 4 ºC, 使用時用蒸餾水稀釋；

4. 10 × Buffer B, 50 ml, 4 ºC, 使用時用蒸餾水稀釋；

5. SDS-PAGE 凝膠蛋白質考馬斯亮藍染色液, 4 ºC。

檢測步驟：

1. 製備含 MMP 底物蛋白的 SDS-PAGE 凝膠：推薦分離膠濃度為(wei) 8%。按照標準程序製備 SDS- PAGE 凝膠。將 10 × substrate G 融化，並 90 ºC 加熱 5 分鍾。分別在濃縮膠和分離膠中額外加 入 10 × substrate G 並使之稀釋 10 倍，混勻後加入過硫酸銨和 TEMED，等待凝膠聚合。

2. 待測樣品 1:1 稀釋於(yu) 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完後可自行配製：4% SDS, 100 mM Tris-Cl pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue)，混合後直接上樣。切勿加熱變性，並且僅(jin) 使用不加還原劑的上樣緩衝(chong) 液。可通過預試驗確定加樣量，使用普通蛋白預染  Marker 即可。陽 性對照(可選步驟)：可取人、小鼠、大鼠或兔 100µl 全血與(yu) 100µl 2 × SDS-PAGE non-

reducing buffer 等體(ti) 積混合，取 5-15µl 上樣。

3. 低電流恒流電泳，每一塊小膠電流為(wei) 20mA/gel。溴酚藍跑出凝膠前沿時結束電泳。

4. 洗滌凝膠：取出凝膠，去除濃縮膠，放入容器內(nei) .可先用適量蒸餾水衝(chong) 洗凝膠，然後加入10ml

1× Buffer A(用蒸餾水稀釋)，室溫漂洗凝膠 2 × 30 分鍾。中間換液。

5.  孵育：倒掉 Buffer A。加入 10 ml 1× Buffer B(蒸餾水稀釋)，室溫或 37ºC 孵育 1~5 小時。陽性 對 照或者血中的 MMP 通常 37ºC 孵育 1 小時即可顯示。如 MMP 活性低，應延長孵育時間為(wei) 10 小時或 過一夜。

6.  顯色：倒掉 Buffer B，加入 SDS-PAGE 凝膠蛋白質考馬斯亮藍染色液（操作步驟見 SDS-PAGE 凝 膠蛋白質考馬斯亮藍染色液說明書(shu) ）。凝膠的大部分區域被深染，在有 MMP 條帶的位置 不被染 色而形成透亮區域。透明區域的位置和範圍指示 MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及 活性。陽 性對照將在 66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa 位置出現透明條帶。

7. 條帶掃描：將凝膠放在掃描儀(yi) 上掃描。雖然 MMP 條帶透明，但凝膠背景並非真正全黑。解決(jue) 辦法：可用非透射光掃描，或用軟件圖像處理程序調整背景顯示為(wei) 灰度顯示，並盡量設置為(wei) 黑色.MMP條帶則為(wei) 白色，這種背景黑條帶白的格式是英文論文中zui常見的格式。

說明

1. 10 mM 能夠 EDTA *抑製 MMP 活性。

2. 凝膠幹燥：可使用聚丙烯酰胺凝膠幹膠裝置室溫快速幹燥凝膠，作為(wei) *記錄保留。

參考文獻：

1. Nagase H and Woessner JF. Matrix Metalloproteinases. J Biol Chem, 1999, 274, 21491-21494

2. Heussen C, and Dowdle EB. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Anal. Biochem，1980, 102, 196–202

SDS-PAGE 凝膠蛋白質考馬斯亮藍染色液說明書(shu) （試劑盒自帶）

常規考馬斯亮藍 SDS-PAGE 凝膠蛋白質染色是實驗室常用的凝膠染色方法。銀染方法雖然靈敏度 高，但所需試劑複雜並且有毒有害，操作步驟繁瑣，難以控製獲得好的染色效果。

染色步驟：

1. 此染色液即為(wei) 工作液，使用時直接將聚丙烯酰胺凝膠放在培養(yang) 皿中以考馬斯亮藍染色液覆蓋凝 膠，並緩慢搖動 2h；

2. 傾(qing) 去染色液，用脫色液衝(chong) 洗凝膠；

3. 以脫色液覆蓋凝膠，緩慢搖動 2h，傾(qing) 去脫色液，再加入新脫色液進行脫色，直至獲得清晰的 藍色的條帶和幹淨的背景（通常此過程需要 2～4h，也可脫色過一夜至清晰的藍色的條帶和幹淨 的背景）；

4. 對凝膠進行分析和照相，凝膠可放置在    7％的乙酸中保存。也可用凝膠幹膠裝置對 凝膠進行處理後保存。

安全性：含有甲醇，無特殊毒性，按一般化學品操作規程處理。

說明：

1. 染色液配方：0.25g 考馬斯亮藍 R250 420ml 甲醇 100ml 冰乙酸，定容至 1000ml，混合 1h 後用 Whatman 1 號濾紙過濾，於(yu) 室溫可無限期保存；

2. 脫色液配方：冰醋酸:甲醇:水＝7:5:88（V:V:V）；

3. 保存液：7％冰醋酸；

4. 凝膠染色之後，染色液可以回收利用，裝入新容器內(nei) ，室溫或 4 ºC 保存，可反複使用 2-4 次。