免疫熒光九標十色（切片）

免疫熒光九標十色（切片）

服務介紹：

免疫熒光九標即利用酪胺信號放大（TSA，Tyramide signal amplification）即TSA技術，在同一張切片上對九種蛋白同時進行標記，從(cong) 而可實現對多種蛋白空間定位，定性及半定量分析。

TSA技術主要原理為(wei) 熒光標記的酪胺在二抗上偶聯的HRP與(yu) H₂O₂的作用下變為(wei) 活化的酪胺並附著在靶標周圍的蛋白酪-氨酸殘基上，此結合是共價(jia) 結合。而一抗與(yu) 靶標、二抗與(yu) 一抗之間是非共價(jia) 結合。通過抗體(ti) 洗脫液處理，非共價(jia) 結合的一抗二抗被洗脫掉，而共價(jia) 結合的熒光酪胺依然附著在靶標周圍，將靶標通過熒光標記顯示出來。在檢測第二個(ge) 靶標時，相當於(yu) 全新的一輪標記，無需考慮第二輪的抗體(ti) 是否與(yu) 第一輪的抗體(ti) 產(chan) 生交叉反應。隻需改變不同種類熒光染料標記TSA即可實現多個(ge) 靶標的標記。通過多次重複免疫標記，使用不同的熒光酪胺實現雙重或多重熒光染色。

送樣運輸要求：

1、石蠟切片常溫保存運輸，冰凍切片﹣20℃保存運輸

2、細胞爬片PFA固定15min後用無菌PBS洗滌，無菌PBS浸泡，4℃冰袋保存運輸到實驗室

實驗大體(ti) 流程：

石蠟切片脫蠟至水——微波抗原修複——畫圈雙氧水封閉——血清封閉——孵育第一種一抗

——孵育HRP二抗——孵育對應的TSA——抗體(ti) 洗脫——血清封閉——孵育第二種一抗

——孵育HRP二抗——孵育對應的TSA——抗體(ti) 洗脫——血清封閉——孵育第三種一抗

——孵育HRP二抗——孵育對應的TSA——抗體(ti) 洗脫——血清封閉——孵育第四種一抗

——孵育HRP二抗——孵育對應的TSA——抗體(ti) 洗脫——血清封閉——孵育第五種一抗

——孵育HRP二抗——孵育對應的TSA——抗體(ti) 洗脫——血清封閉——孵育第六種一抗

——孵育HRP二抗——孵育對應的TSA——抗體(ti) 洗脫——血清封閉——孵育第七種一抗

——孵育HRP二抗——孵育對應的TSA——抗體(ti) 洗脫——血清封閉——孵育第八種一抗

——孵育HRP二抗——孵育對應的TSA——抗體(ti) 洗脫——血清封閉——孵育第九種一抗

——孵育HRP二抗——孵育對應的TSA——DAPI染核——自發熒光淬滅——抗熒光淬滅封片劑封片——掃描全景成像。

（TSA熒光染料的搭配及加樣順序根據各抗體(ti) 的表達情況來確定。）

實驗具體(ti) 流程：

1、石蠟切片脫蠟至水：依次將石蠟切片放入環保型脫蠟液I 10min-環保型脫蠟液II 10min-環保型脫蠟液III 10min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-無水乙醇Ⅲ 5min-蒸餾水洗。

2、抗原修複：組織切片置於(yu) 盛滿抗原修複緩衝(chong) 液 PH 6.0 檸檬酸；PH 9.0 EDTA；PH 8.0 EDTA）的抗原修複盒中於(yu) 微波爐內(nei) 進行抗原修複。維持緩衝(chong) 液沸騰10min左右，此過程中應防止緩衝(chong) 液過度蒸發，切勿幹片。自然冷卻後將玻片置於(yu) PH7.4 PBS中在鍾擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min(修複液種類和修複條件根據組織來確定，優(you) 先推薦PH 6.0 檸檬酸修複液）。

3、畫圈, 雙氧水封閉：切片稍甩幹後用免疫組化筆在組織周圍畫圈（防止試劑流走），切片平放於(yu) 避光濕盒滴加3%雙氧水溶液，室溫避光孵育25 min左右，封閉內(nei) 源性過氧化物酶。將玻片置於(yu) PH7.4 PBS中在鍾擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

4、血清封閉:切片平放於(yu) 避光濕盒滴加血清室溫封閉30min。一抗是山羊來源用10%兔血清封閉，一抗其它來源的用3%BSA封閉。

5、加第一種一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加用無菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放於(yu) 避光濕盒內(nei) 4°C孵育過夜（濕盒內(nei) 加少量水防止抗體(ti) 蒸發）。

6、加對應種屬HRP標記二抗：將玻片置於(yu) PH7.4 PBS中在鍾擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩幹後平放於(yu) 透明濕盒在圈內(nei) 滴加與(yu) 一抗相應種屬的HRP標記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min。

7、加對應的TSA：將玻片置於(yu) PH7.4 PBS中在鍾擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩幹後將切片平放於(yu) 避光濕盒在圈內(nei) 滴加對應的TSA，避光室溫孵育10min。 孵育完後，將玻片置於(yu) TBST中在鍾擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

至此步驟，第一支抗體(ti) 標記完成。

8、抗體(ti) 洗脫：切片稍甩幹後，滴加抗體(ti) 洗脫液鋪滿整個(ge) 組織，室溫孵育5 min後去除抗體(ti) 洗脫液，再次滴加足量的抗體(ti) 洗脫液完-全覆蓋組織，37°C孵育30 min，孵育完成後將玻片置於(yu) TBST中在鍾擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

9、血清封閉:切片平放於(yu) 避光濕盒滴加血清室溫封閉30min。一抗是山羊來源用10%兔血清封閉，一抗其它來源的用3%BSA封閉。

10、加第二種一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加用無菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放於(yu) 避光濕盒內(nei) 4°C孵育過夜（濕盒內(nei) 加少量水防止抗體(ti) 蒸發）。

11、加對應種屬HRP標記二抗：將玻片置於(yu) PH7.4 PBS中在鍾擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩幹後在圈內(nei) 滴加與(yu) 一抗相應種屬的HRP標記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min。

12、加對應的TSA：將玻片置於(yu) PH7.4 PBS中在鍾擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩幹後將切片平放於(yu) 避光濕盒在圈內(nei) 滴加對應的TSA，避光室溫孵育10min。 孵育完後，將玻片置於(yu) TBST中在鍾擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

至此步驟，第二支抗體(ti) 標記完成。

備注：步驟4-7為(wei) 第一支抗體(ti) 標記過程，步驟8-12為(wei) 第二支抗體(ti) 標記過程，每輪抗體(ti) 標記隻需更換不同熒光素標記的TSA。 每標記完一支抗體(ti) ，進行抗體(ti) 洗脫，去除此輪標記的一抗，二抗後， 再繼續下一輪的抗體(ti) 標記過程。根據熒光多標的抗體(ti) 數量，重複以上步驟，直至完成所有的抗體(ti) 標記，再進入後續染核，淬滅自發熒光的步驟。

13、DAPI複染細胞核：切片稍甩幹後將切片平放於(yu) 避光濕盒在圈內(nei) 滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。將玻片置於(yu) PH7.4 PBS中在鍾擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

14、自發熒光淬滅：切片稍甩幹後將切片平放於(yu) 避光濕盒在圈內(nei) 加入自發熒光淬滅劑5min，流水衝(chong) 洗10min。

15、封片：將玻片置於(yu) PH7.4 PBS中在鍾擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩幹後用抗熒光淬滅封片劑封片。