免疫熒光六標七色（芯片）

免疫熒光六標七色（芯片）

服務介紹：　

組織芯片的免疫熒光檢測，是將許多不同個(ge) 體(ti) 組織標本以規則微陣列方式排布於(yu) 同一載玻片上，同時進行相同指標的免疫熒光檢測。組織芯片熒光六標實驗是在同一張組織芯片上對六個(ge) 抗原進行同時標記，從(cong) 而實現定性，定位，半定量分析。 組織芯片的免疫熒光檢測，標本體(ti) 積小, 標本信息含量大 , 一次性實驗即可獲大量結果。實驗條件更易控製一致，減少批間批內(nei) 誤差，結果更準確。

送樣運輸要求：

1、組織樣本放置於(yu) 10倍樣本體(ti) 積的通用型組織固定液中固定24h以上，常溫保存運輸石蠟包埋切片。切勿冷凍結冰，切勿固定時間過長。

2、石蠟切片常溫保存運輸。

3、熒光四標隻能做石蠟包埋切片，不能做冰凍切片和細胞爬片。

實驗大體(ti) 流程：

石蠟切片脫蠟至水——微波抗原修複——畫圈雙氧水封閉——血清封閉——孵育第一種一抗——孵育HRP二抗——孵育iF440-TSA——微波處理——血清封閉——孵育第二種一抗——孵育HRP二抗——孵育iF488-TSA——微波處理——血清封閉——孵育第三種一抗——孵育HRP二抗——孵育iF546-TSA——微波處理——血清封閉——孵育第四種一抗——孵育HRP二抗——孵育iF594-TSA——微波處理——血清封閉——孵育第五種一抗——孵育HRP二抗——孵育iF647-TSA——微波處理——血清封閉——孵育第六種一抗——孵育HRP二抗孵育iF700-TSA——DAPI染核——自發熒光淬滅——抗熒光淬滅封片劑封片——掃描全景成像。

實驗具體(ti) 流程：

1、石蠟切片脫蠟至水：依次將石蠟切片放入環保型脫蠟液I 10min-環保型脫蠟液I 10min-環保型脫蠟液III 10min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-無水乙醇Ⅲ 5min-蒸餾水洗。

2、抗原修複：組織切片置於(yu) 盛滿抗原修複緩衝(chong) 液PH 6.0 檸檬酸； PH 9.0 EDTA；PH 8.0 EDTA）的抗原修複盒中於(yu) 微波爐內(nei) 進行抗原修複。維持緩衝(chong) 液沸騰10min左右，此過程中應防止緩衝(chong) 液過度蒸發，切勿幹片。自然冷卻後將玻片置於(yu) PH7.4 PBS中在鍾擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min(修複液種類和修複條件根據組織來確定，優(you) 先推薦PH 6.0 檸檬酸修複液）。

3、畫圈, 雙氧水封閉：切片稍甩幹後用免疫組化筆在組織周圍畫圈（防止試劑流走），切片平放於(yu) 避光濕盒滴加3%雙氧水溶液，室溫避光孵育25 min左右，封閉內(nei) 源性過氧化物酶。將玻片置於(yu) PH7.4 PBS中在鍾擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

4、血清封閉:切片平放於(yu) 透明濕盒滴加血清室溫封閉30min。一抗是山羊來源用10%兔血清封閉，一抗其它來源的用3%BSA封閉。

5、加第一種一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加用無菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放於(yu) 透明濕盒內(nei) 4°C孵育過夜（濕盒內(nei) 加少量水防止抗體(ti) 蒸發）。

6、加對應種屬HRP標記二抗：將玻片置於(yu) PH7.4 PBS中在鍾擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩幹後平放於(yu) 透明濕盒在圈內(nei) 滴加與(yu) 一抗相應種屬的HRP標記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min。

7、加iF440-TSA：將玻片置於(yu) PH7.4 PBS）中在鍾擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩幹後將切片平放於(yu) 避光濕盒在圈內(nei) 滴加iF440-TSA，避光室溫孵育10min。 孵育完後，將玻片置於(yu) TBST中在鍾擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

8、微波處理：組織切片置於(yu) 盛滿PH 6.0 檸檬酸修複液的修複盒中於(yu) 微波爐內(nei) 加熱處理維持沸騰10min左右去掉已經結合到組織上的一抗二抗，此過程中應防止緩衝(chong) 液過度蒸發，切勿幹片。

9、血清封閉:切片平放於(yu) 透明濕盒滴加血清室溫封閉30min。一抗是山羊來源用10%兔血清封閉，一抗其它來源的用3%BSA封閉。

10、加第二種一抗：在切片上滴加用無菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放於(yu) 避光濕盒內(nei) 4°C孵育過夜（濕盒內(nei) 加少量水防止抗體(ti) 蒸發）。

11、加對應種屬HRP標記二抗：將玻片置於(yu) PH7.4 PBS中在鍾擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩幹後在圈內(nei) 滴加與(yu) 一抗相應種屬的HRP標記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min。

12、加iF488-TSA：將玻片置於(yu) PH7.4 PBS中在鍾擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩幹後將切片平放於(yu) 避光濕盒在圈內(nei) 滴加iF488-TSA，避光室溫孵育10min。 孵育完後，將玻片置於(yu) TBST中在鍾擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

13、微波處理：組織切片置於(yu) 盛滿PH 6.0 檸檬酸修複液的修複盒中於(yu) 微波爐內(nei) 加熱處理維持沸騰10min左右去掉已經結合到組織上的一抗二抗，此過程中應防止緩衝(chong) 液過度蒸發，切勿幹片。

14、血清封閉:切片平放於(yu) 透明濕盒（滴加血清室溫封閉30min。一抗是山羊來源用10%兔血清封閉，一抗其它來源的用3%BSA封閉。

15、加第三種一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加用無菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放於(yu) 避光濕盒內(nei) 4°C孵育過夜（濕盒內(nei) 加少量水防止抗體(ti) 蒸發）。

16、對應的HRP標記的二抗：將玻片置於(yu) PH7.4 PBS中在鍾擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩幹後將切片平放於(yu) 避光濕盒在圈內(nei) 滴加與(yu) 一抗相應種屬的HRP標記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min。

17、加iF546-TSA：將玻片置於(yu) PH7.4 PBS中在鍾擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩幹後將切片平放於(yu) 避光濕盒在圈內(nei) 滴加iF546-TSA，避光室溫孵育10min。 孵育完後，將玻片置於(yu) TBST中在鍾擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

18、微波處理：組織切片置於(yu) 盛滿PH 6.0 檸檬酸修複液的修複盒中於(yu) 微波爐內(nei) 加熱處理維持沸騰10min左右去掉已經結合到組織上的一抗二抗，此過程中應防止緩衝(chong) 液過度蒸發，切勿幹片。

19、血清封閉:切片平放於(yu) 透明濕盒滴加血清室溫封閉30min。一抗是山羊來源用10%兔血清封閉，一抗其它來源的用3%BSA封閉。

20、加第四種一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加用無菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放於(yu) 避光濕盒內(nei) 4°C孵育過夜（濕盒內(nei) 加少量水防止抗體(ti) 蒸發）。

21、對應的HRP標記的二抗：將玻片置於(yu) PH7.4 PBS中在鍾擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩幹後將切片平放於(yu) 避光濕盒在圈內(nei) 滴加與(yu) 一抗相應種屬的HRP標記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min。

22、加iF594-TSA：將玻片置於(yu) PH7.4 PBS中在鍾擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩幹後將切片平放於(yu) 避光濕盒在圈內(nei) 滴加iF594-TSA，避光室溫孵育10min。 孵育完後，將玻片置於(yu) TBST中在鍾擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

23、微波處理：組織切片置於(yu) 盛滿PH 6.0 檸檬酸修複液的修複盒中於(yu) 微波爐內(nei) 加熱處理維持沸騰10min左右去掉已經結合到組織上的一抗二抗，此過程中應防止緩衝(chong) 液過度蒸發，切勿幹片。

24、血清封閉:切片平放於(yu) 透明濕盒滴加血清室溫封閉30min。一抗是山羊來源用10%兔血清封閉，一抗其它來源的用3%BSA封閉。

25、加第五種一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加用無菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放於(yu) 避光濕盒內(nei) 4°C孵育過夜（濕盒內(nei) 加少量水防止抗體(ti) 蒸發）。

26、對應的HRP標記的二抗：將玻片置於(yu) PH7.4 PBS中在鍾擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩幹後將切片平放於(yu) 避光濕盒在圈內(nei) 滴加與(yu) 一抗相應種屬的HRP標記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min。

27、加iF647-TSA：將玻片置於(yu) PH7.4 PBS中在鍾擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩幹後將切片平放於(yu) 避光濕盒在圈內(nei) 滴加iF647-TSA，避光室溫孵育10min。 孵育完後，將玻片置於(yu) TBST中在鍾擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

28、微波處理：組織切片置於(yu) 盛滿PH 6.0 檸檬酸修複液的修複盒中於(yu) 微波爐內(nei) 加熱處理維持沸騰10min左右去掉已經結合到組織上的一抗二抗，此過程中應防止緩衝(chong) 液過度蒸發，切勿幹片。

29、血清封閉:切片平放於(yu) 透明濕盒滴加血清室溫封閉30min。一抗是山羊來源用10%兔血清封閉，一抗其它來源的用3%BSA封閉。

30、加第六種一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加用無菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放於(yu) 避光濕盒內(nei) 4°C孵育過夜（濕盒內(nei) 加少量水防止抗體(ti) 蒸發）。

31、對應的HRP標記的二抗：將玻片置於(yu) PH7.4 PBS中在鍾擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩幹後將切片平放於(yu) 避光濕盒在圈內(nei) 滴加與(yu) 一抗相應種屬的HRP標記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min。

32、加iF700-TSA：將玻片置於(yu) PH7.4 PBS中在鍾擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩幹後將切片平放於(yu) 避光濕盒在圈內(nei) 滴加iF700-TSA，避光室溫孵育10min。 孵育完後，將玻片置於(yu) TBST中在鍾擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

33、DAPI複染細胞核：切片稍甩幹後將切片平放於(yu) 避光濕盒在圈內(nei) 滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。將玻片置於(yu) PH7.4 PBS中在鍾擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

34、自發熒光淬滅：切片稍甩幹後將切片平放於(yu) 避光濕盒在圈內(nei) 加入自發熒光淬滅劑5min，流水衝(chong) 洗10min。

35、封片：將玻片置於(yu) PH7.4 PB中在鍾擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩幹後用抗熒光淬滅封片劑封片。

36、鏡檢成像：切片置於(yu) 玻片數字掃描儀(yi) 下掃描全景成像。