免疫熒光三標四色（芯片）

免疫熒光三標四色（芯片）

服務介紹：　　

組織芯片的免疫熒光檢測，是將許多不同個(ge) 體(ti) 組織標本以規則微陣列方式排布於(yu) 同一載玻片上，同時進行相同指標的免疫熒光檢測。組織芯片熒光三標實驗室在同一張組織芯片上對三個(ge) 抗原進行同時標記，從(cong) 而實現定性，定位，半定量分析。 組織芯片的免疫熒光檢測，標本體(ti) 積小, 標本信息含量大 , 一次性實驗即可獲大量結果。實驗條件更易控製一致，減少批間批內(nei) 誤差，結果更準確。

實驗流程：

1. 石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入環保型脫蠟液10min-環保型脫蠟液10min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-無水乙醇Ⅲ5min-蒸餾水洗。

2. 抗原修複：組織切片置於(yu) 盛滿EDTA抗原修複緩衝(chong) 液（PH8.0）的修複盒中於(yu) 微波爐內(nei) 進行抗原修複。中火8min停火8min轉中低火7min，此過程中應防止緩衝(chong) 液過度蒸發，切勿幹片。自然冷卻後將玻片置於(yu) PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。(修複液和修複條件根據組織來確定）

3. 畫圈：切片稍甩幹後用組化筆在組織周圍畫圈（防止抗體(ti) 流走）

4. 血清封閉:在圈內(nei) 滴加BSA孵育30min。（一抗若是山羊來源，則加兔血清）

5. 加第一種一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放於(yu) 濕盒內(nei) 4°C孵育過夜。（濕盒內(nei) 加少量水防止抗體(ti) 蒸發）

6. 加對應的HRP標記的二抗：玻片置於(yu) PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩幹後在圈內(nei) 滴加與(yu) 一抗相應種屬的HRP標記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min。

7. 加CY3熒光增強劑：玻片置於(yu) PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩幹後在圈內(nei) 滴加CY3熒光增強劑，避光室溫孵育10min. 孵育完後，玻片置於(yu) TBST中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min

8. 微波處理：組織切片置於(yu) 盛滿EDTA抗原修複緩衝(chong) 液（PH8.0）的修複盒中於(yu) 微波爐內(nei) 加熱處理，中火8min停火8min轉中低火7min，去掉已經結合到組織上的一抗二抗，此過程中應防止緩衝(chong) 液過度蒸發，切勿幹片。

9. 加第二種一抗：在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放於(yu) 濕盒內(nei) 4°C孵育過夜。（濕盒內(nei) 加少量水防止抗體(ti) 蒸發）

10. 加對應的HRP標記的二抗：玻片置於(yu) PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩幹後在圈內(nei) 滴加與(yu) 一抗相應種屬的HRP標記的二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50min。

11. 加FITC熒光增強劑：玻片置於(yu) PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩幹後在圈內(nei) 滴加FITC熒光增強劑，避光室溫孵育10min. 孵育完後，玻片置於(yu) TBST中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min

12. 微波處理：組織切片置於(yu) 盛滿EDTA抗原修複緩衝(chong) 液（PH8.0）的修複盒中於(yu) 微波爐內(nei) 加熱處理，中火8min停火8min轉中低火7min，去掉已經結合到組織上的一抗二抗，此過程中應防止緩衝(chong) 液過度蒸發，切勿幹片。

13. 加第三種一抗：在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放於(yu) 濕盒內(nei) 4°C孵育過夜。（濕盒內(nei) 加少量水防止抗體(ti) 蒸發）

14. 加CY5標記的熒光二抗：玻片置於(yu) PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩幹後在圈內(nei) 滴加與(yu) 一抗相應種屬的CY5標記熒光二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50min。孵育完後，玻片置於(yu) PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

15. DAPI複染細胞核：切片稍甩幹後在圈內(nei) 滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。

16. 自發熒光淬滅：切片稍甩幹後，在圈內(nei) 加入自發熒光淬滅劑5min，流水衝(chong) 洗10min。

17. 封片：玻片置於(yu) PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩幹後用抗熒光淬滅封片劑封片。

18. 鏡檢拍照：切片置於(yu) 掃描儀(yi) 下采集圖像。（DAPI紫外激發波長330-380nm，發射波長420nm，發藍光；FITC激發波長465-495nm，發射波長515-555 nm，發綠光；CY3激發波長510-560，發射波長590nm，發紅光. CY5激發波長 608-648nm, 發射波長672-712,，CY5原本為(wei) 正紅色，為(wei) 了與(yu) CY3區分開，我們(men) 設定為(wei) 粉色光。 DAPI染出來的細胞核在紫外的激發下為(wei) 藍色，陽性表達為(wei) 相應熒光素標記的紅光，粉光，綠光 。

送樣運輸要求：

1、樣本放置於(yu) 20倍樣本體(ti) 積的固定液中固定24h以上，常溫運輸送樣。切勿固定時間過長，切勿冷凍結冰。

2、熒光三標隻能做石蠟包埋切片，不能做冰凍切片和細胞爬片。