免疫熒光雙標三色（切片）

免疫熒光雙標三色（切片）

服務介紹：

免疫熒光雙重標記即利用抗原抗體(ti) 特異性結合原理，在同一張切片上兩(liang) 個(ge) 抗原進行同時標記，從(cong) 而實現定位，定性，半定量的分析。

實驗流程：

　　異源雙標：

1、 石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入環保型脫蠟液10min-環保型脫蠟液10min-環保型脫蠟液10min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-無水乙醇Ⅲ5min-蒸餾水洗。

2、 抗原修複：組織切片置於(yu) 盛滿EDTA抗原修複緩衝(chong) 液（PH8.0）的修複盒中於(yu) 微波爐內(nei) 進行抗原修複。中火8min至沸，停火8min，轉中低火7min，此過程中應防止緩衝(chong) 液過度蒸發，切勿幹片。自然冷卻後將玻片置於(yu) PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。(修複液和修複條件根據組織來確定）

3、 畫圈：切片稍甩幹後用組化筆在組織周圍畫圈（防止抗體(ti) 流走）

4、 血清封閉:在圈內(nei) 滴加BSA孵育30min。（一抗若是山羊來源，則加驢血清）

5、 加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，兩(liang) 種一抗按一定的稀釋比例混合，滴加到組織上，切片平放於(yu) 濕盒內(nei) 4°C孵育過夜。（濕盒內(nei) 加少量水防止抗體(ti) 蒸發）

6、 加二抗：玻片置於(yu) PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩幹後在圈內(nei) 滴加與(yu) 一抗相應種屬標記的按一定比例配好的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min。（兩(liang) 種二抗，按照一定的比例混合孵育）

7、 DAPI複染細胞核：切片稍甩幹後在圈內(nei) 滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。

8、 自發熒光淬滅：切片稍甩幹後，在圈內(nei) 加入自發熒光淬滅劑5min，流水衝(chong) 洗10min。

9、 封片：玻片置於(yu) PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩幹後用抗熒光淬滅封片劑封片。

10、 鏡檢拍照：切片置於(yu) 掃描儀(yi) 下采集圖像。（DAPI紫外激發波長330-380nm，發射波長420nm，發藍光；FITC激發波長465-495nm，發射波長515-555 nm，發綠光；CY3激發波長510-560，發射波長590nm，發紅光. CY5激發波長 608-648nm, 發射波長672-712。 DAPI染出來的細胞核在紫外的激發下為(wei) 藍色，陽性表達為(wei) 相應熒光素標記的紅光，綠光 。

　　同源雙標：

1、石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入環保型脫蠟液I 10min-環保型脫蠟液II 10min-環保型脫蠟液III 10min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-無水乙醇Ⅲ5min-蒸餾水洗。

2、 抗原修複：組織切片置於(yu) 盛滿EDTA抗原修複緩衝(chong) 液（PH8.0）的修複盒中於(yu) 微波爐內(nei) 進行抗原修複。中火8min停火8min轉中低火7min，此過程中應防止緩衝(chong) 液過度蒸發，切勿幹片。自然冷卻後將玻片置於(yu) PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。(修複液和修複條件根據組織來確定）

3、 畫圈,雙氧水封閉：切片稍甩幹後用組化筆在組織周圍畫圈（防止抗體(ti) 流走），切片放入3%雙氧水溶液，室溫避光孵育25 min，封閉內(nei) 源性的過氧化物酶，將玻片置於(yu) PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min

4、 血清封閉: 甩幹PBS, 滴加BSA，封閉30min。（一抗是山羊來源用10%兔血清封閉，一抗其它來源的用3%BSA封閉）

5 、加第一種一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放於(yu) 濕盒內(nei) 4°C孵育過夜。（濕盒內(nei) 加少量水防止抗體(ti) 蒸發）

6 、加對應的HRP標記的二抗：玻片置於(yu) PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩幹後在圈內(nei) 滴加與(yu) 一抗相應種屬的HRP標記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min。

7 、加CY3-TSA（或FITC-TSA）：玻片置於(yu) PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩幹後在圈內(nei) 滴加TSA，避光室溫孵育10min. 孵育完後，玻片置於(yu) TBST中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min

8 、微波處理：組織切片置於(yu) 盛滿EDTA抗原修複緩衝(chong) 液（PH8.0）的修複盒中於(yu) 微波爐內(nei) 加熱處理，中火8min停火8min轉中低火7min，去掉已經結合到組織上的一抗二抗，此過程中應防止緩衝(chong) 液過度蒸發，切勿幹片。

9、 加第二種一抗：在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放於(yu) 濕盒內(nei) 4°C孵育過夜。（濕盒內(nei) 加少量水防止抗體(ti) 蒸發）。

10、 加對應的二抗：玻片置於(yu) PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩幹後在圈內(nei) 滴加與(yu) 一抗相應種屬的熒光二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50min。

11、 DAPI複染細胞核：切片稍甩幹後在圈內(nei) 滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。

12、 自發熒光淬滅：玻片置於(yu) PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩幹後，在圈內(nei) 加入自發熒光淬滅劑5min，流水衝(chong) 洗10min。

13 、封片：切片稍甩幹後用抗熒光淬滅封片劑封片。

14 、鏡檢拍照：切片於(yu) 熒光顯微鏡下觀察並采集圖像。（DAPI紫外激發波長330-380nm，發射波長420nm，發藍光；FITC激發波長465-495nm，發射波長515-555 nm，發綠光；CY3激發波長510-560，發射波長590nm，發紅光.

同源雙標技術原理介紹：

主要原理是基於(yu) 酪胺信號放大（TSA，Tyramide signal amplification），以下簡稱TSA技術。TSA是一種基於(yu) 辣根過氧化物酶HRP的催化活性對靶蛋白或核酸進行高密度原位標記的酶學檢測方法。技術主要原理為(wei) 熒光標記的酪胺在HRP與(yu) H2O2的作用下變為(wei) 活化的酪胺，附著在靶標周圍的蛋白酪-氨酸殘基上。此結合是共價(jia) 結合，而一抗與(yu) 靶標、二抗與(yu) 一抗之間是非共價(jia) 結合，通過微波修複處理，第一輪的一抗二抗被洗脫，熒光標記的酪胺依然附著在靶標周圍。在檢測第二個(ge) 靶標時，相當於(yu) 全新的一輪標記，無需考慮第二輪的抗體(ti) 是否與(yu) 第一輪的抗體(ti) 產(chan) 生交叉反應。隻需變化不同熒光標記即可實現多個(ge) 靶標的標記。通過多次重複免疫標記，使用不同的熒光酪胺實現雙重或多重熒光染色

送樣運輸要求：

1.冰凍切片-20℃保存和運輸。

2.石蠟切片常溫運輸至實驗室。

3.細胞爬片PFA固定15min後用無菌PBS洗滌後用無菌PBS浸泡，4℃冰袋保存運輸到實驗室