免疫熒光三標四色掃描全套（芯片）

免疫熒光三標四色掃描全套（芯片）

服務介紹：

免疫熒光四標即利用酪胺信號放大（TSA，Tyramide signal amplification）即TSA技術，在同一張切片上對三種蛋白同時進行標記，從(cong) 而可實現對多種蛋白空間定位，定性及半定量分析。

TSA技術主要原理為(wei) 熒光標記的酪胺在二抗上偶聯的HRP與(yu) H₂O₂的作用下變為(wei) 活化的酪胺並附著在靶標周圍的蛋白酪-氨酸殘基上，此結合是共價(jia) 結合。而一抗與(yu) 靶標、二抗與(yu) 一抗之間是非共價(jia) 結合。通過微波處理，非共價(jia) 結合的一抗二抗被打斷並洗脫掉，而共價(jia) 結合的熒光酪胺依然附著在靶標周圍，將靶標通過熒光標記顯示出來。在檢測第二個(ge) 靶標時，相當於(yu) 全新的一輪標記，無需考慮第二輪的抗體(ti) 是否與(yu) 第一輪的抗體(ti) 產(chan) 生交叉反應。隻需改變不同種類熒光染料標記TSA即可實現多個(ge) 靶標的標記。通過多次重複免疫標記，使用不同的熒光酪胺實現雙重或多重熒光染色

送樣運輸要求：

1、組織樣本放置於(yu) 10倍樣本體(ti) 積的通用型組織固定液中固定24h以上，常溫保存運輸石蠟包埋切片。切勿冷凍結冰，切勿固定時間過長。

2、石蠟切片常溫保存運輸。

3、熒光四標隻能做石蠟包埋切片，不能做冰凍切片和細胞爬片。

實驗大體(ti) 流程：

石蠟切片脫蠟至水——微波抗原修複——畫圈雙氧水封閉——血清封閉——孵育第一種一抗——孵育HRP二抗——孵育iF555-TSA——微波處理——血清封閉——孵育第二種一抗——孵育HRP二抗——孵育iF488-TSA——微波處理——血清封閉——孵育第三種一抗——孵育iF647熒光二抗——DAPI染核——自發熒光淬滅——抗熒光淬滅封片劑封片——掃描全景成像。

實驗具體(ti) 流程：

1、石蠟切片脫蠟至水：依次將石蠟切片放入環保型脫蠟液I 10min-環保型脫蠟液I 10min-環保型脫蠟液III 10min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-無水乙醇Ⅲ 5min-蒸餾水洗。

2、抗原修複：組織切片置於(yu) 盛滿抗原修複緩衝(chong) 液（ PH 6.0 檸檬酸；PH 9.0 EDTA； PH 8.0 EDTA）的抗原修複盒中於(yu) 微波爐內(nei) 進行抗原修複。維持緩衝(chong) 液沸騰10min左右，此過程中應防止緩衝(chong) 液過度蒸發，切勿幹片。自然冷卻後將玻片置於(yu) PH7.4 PBS中在鍾擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min(修複液種類和修複條件根據組織來確定）。

3、畫圈, 雙氧水封閉：切片稍甩幹後用免疫組化筆在組織周圍畫圈（防止試劑流走），切片平放於(yu) 避光濕盒滴加3%雙氧水溶液，室溫避光孵育25 min左右，封閉內(nei) 源性過氧化物酶。將玻片置於(yu) PH7.4 PBS中在鍾擺搖床晃動洗滌3次，每次5min。

4、血清封閉:切片平放於(yu) 透明濕盒滴加血清室溫封閉30min。一抗是山羊來源用10%兔血清封閉，一抗其它來源的用3%BSA封閉。

5、加第一種一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加用無菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放於(yu) 透明濕盒內(nei) 4°C孵育過夜（濕盒內(nei) 加少量水防止抗體(ti) 蒸發）。

6、加對應種屬HRP標記二抗：將玻片置於(yu) PH7.4 PBS中在鍾擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩幹後平放於(yu) 透明濕盒在圈內(nei) 滴加與(yu) 一抗相應種屬的HRP標記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min。

7、加iF555-TSA：將玻片置於(yu) PH7.4 PBS中在鍾擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩幹後將切片平放於(yu) 避光濕盒在圈內(nei) 滴加iF555-TSA，避光室溫孵育10min。 孵育完後，將玻片置於(yu) TBST中在鍾擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

8、微波處理：組織切片置於(yu) 盛滿PH 6.0 檸檬酸修複液的修複盒中於(yu) 微波爐內(nei) 加熱處理維持沸騰10min左右去掉已經結合到組織上的一抗二抗，此過程中應防止緩衝(chong) 液過度蒸發，切勿幹片。

9、血清封閉:切片平放於(yu) 透明濕盒滴加血清室溫封閉30min。一抗是山羊來源用10%兔血清封閉，一抗其它來源的用3%BSA封閉。

10、加第二種一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加用無菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放於(yu) 避光濕盒內(nei) 4°C孵育過夜（濕盒內(nei) 加少量水防止抗體(ti) 蒸發）。

11、加對應種屬HRP標記二抗：將玻片置於(yu) PH7.4 PBS中在鍾擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩幹後在圈內(nei) 滴加與(yu) 一抗相應種屬的HRP標記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min。

12、加iF488-TSA：將玻片置於(yu) PH7.4 PBS中在鍾擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩幹後將切片平放於(yu) 避光濕盒在圈內(nei) 滴加iF488-TSA，避光室溫孵育10min。 孵育完後，將玻片置於(yu) TBST中在鍾擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

13、微波處理：組織切片置於(yu) 盛滿PH 6.0 檸檬酸修複液的修複盒中於(yu) 微波爐內(nei) 加熱處理維持沸騰10min左右去掉已經結合到組織上的一抗二抗，此過程中應防止緩衝(chong) 液過度蒸發，切勿幹片。

14、血清封閉:切片平放於(yu) 透明濕盒滴加血清室溫封閉30min。一抗是山羊來源用10%兔血清封閉，一抗其它來源的用3%BSA封閉。

15、加第三種一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加用無菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放於(yu) 避光濕盒內(nei) 4°C孵育過夜（濕盒內(nei) 加少量水防止抗體(ti) 蒸發）。

16、加iF647標記的二抗：將玻片置於(yu) PH7.4 PBS中在鍾擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩幹後將切片平放於(yu) 避光濕盒在圈內(nei) 滴加與(yu) 一抗相應種屬的iF647標記的熒光二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50min。孵育完後，將玻片置於(yu) PH7.4 PBS中在鍾擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

17、DAPI複染細胞核：切片稍甩幹後將切片平放於(yu) 避光濕盒在圈內(nei) 滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。將玻片置於(yu) PH7.4 PBS中在鍾擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

18、自發熒光淬滅：切片稍甩幹後將切片平放於(yu) 避光濕盒在圈內(nei) 加入自發熒光淬滅劑5min，流水衝(chong) 洗10min。

19、封片：將玻片置於(yu) PH7.4 PBS中在鍾擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩幹後用抗熒光淬滅封片劑封片。

20、鏡檢成像：切片置於(yu) 玻片數字掃描儀(yi) 下掃描全景成像。