免疫熒光四標五色（芯片）

免疫熒光四標五色（芯片）

服務介紹：　

組織芯片的免疫熒光檢測，是將許多不同個(ge) 體(ti) 組織標本以規則微陣列方式排布於(yu) 同一載玻片上，同時進行相同指標的免疫熒光檢測。組織芯片熒光四標實驗是在同一張組織芯片上對四個(ge) 抗原進行同時標記，從(cong) 而實現定性，定位，半定量分析。 組織芯片的免疫熒光檢測，標本體(ti) 積小, 標本信息含量大 , 一次性實驗即可獲大量結果。實驗條件更易控製一致，減少批間批內(nei) 誤差，結果更準確。

實驗流程：

1石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入環保型脫蠟液I 10min-環保型脫蠟液II 10min-環保型脫蠟液III 10min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-無水乙醇Ⅲ5min-蒸餾水洗。

2 抗原修複：組織切片置於(yu) 盛滿EDTA抗原修複緩衝(chong) 液（PH8.0）的修複盒中於(yu) 微波爐內(nei) 進行抗原修複。中火8min停火8min轉中低火7min，此過程中應防止緩衝(chong) 液過度蒸發，切勿幹片。自然冷卻後將玻片置於(yu) PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。(修複液和修複條件根據組織來確定）

3 畫圈, 雙氧水封閉：切片稍甩幹後用組化筆在組織周圍畫圈（防止抗體(ti) 流走），切片放入3%雙氧水溶液，室溫避光孵育25 min，封閉內(nei) 源性的過氧化物酶，將玻片置於(yu) PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min

4 血清封閉:滴加BSA，封閉30min。（一抗是山羊來源用10%兔血清封閉，一抗其它來源的用3%BSA封閉）

5 加第一種一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放於(yu) 濕盒內(nei) 4°C孵育過夜。（濕盒內(nei) 加少量水防止抗體(ti) 蒸發）

6 加對應的HRP標記的二抗：玻片置於(yu) PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩幹後在圈內(nei) 滴加與(yu) 一抗相應種屬的HRP標記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min。

7 加CY3-TSA：玻片置於(yu) PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩幹後在圈內(nei) 滴加CY3-TSA，避光室溫孵育10min. 孵育完後，玻片置於(yu) TBST中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min

8 微波處理：組織切片置於(yu) 盛滿EDTA抗原修複緩衝(chong) 液（PH8.0）的修複盒中於(yu) 微波爐內(nei) 加熱處理，中火8min停火8min轉中低火7min，去掉已經結合到組織上的一抗二抗，此過程中應防止緩衝(chong) 液過度蒸發，切勿幹片。

9 加第二種一抗：在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放於(yu) 濕盒內(nei) 4°C孵育過夜。（濕盒內(nei) 加少量水防止抗體(ti) 蒸發）

10 加對應的HRP標記的二抗：玻片置於(yu) PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩幹後在圈內(nei) 滴加與(yu) 一抗相應種屬的HRP標記的二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50min。

11 加FITC-TSA：玻片置於(yu) PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩幹後在圈內(nei) 滴加TSA，避光室溫孵育10min. 孵育完後，玻片置於(yu) TBST中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min

12 微波處理：組織切片置於(yu) 盛滿EDTA抗原修複緩衝(chong) 液（PH8.0）的修複盒中於(yu) 微波爐內(nei) 加熱處理，中火8min停火8min轉中低火7min，去掉已經結合到組織上的一抗二抗，此過程中應防止緩衝(chong) 液過度蒸發，切勿幹片。

13 加第三種一抗：在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放於(yu) 濕盒內(nei) 4°C孵育過夜。（濕盒內(nei) 加少量水防止抗體(ti) 蒸發）

14 加對應的HRP標記的二抗：玻片置於(yu) PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩幹後在圈內(nei) 滴加與(yu) 一抗相應種屬的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min。孵育完後，玻片置於(yu) PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

15 加647-TSA：玻片置於(yu) PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩幹後在圈內(nei) 滴加TSA，避光室溫孵育10min. 孵育完後，玻片置於(yu) TBST中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min

16 微波處理：組織切片置於(yu) 盛滿EDTA抗原修複緩衝(chong) 液（PH8.0）的修複盒中於(yu) 微波爐內(nei) 加熱處理，中火8min停火8min轉中低火7min，去掉已經結合到組織上的一抗二抗，此過程中應防止緩衝(chong) 液過度蒸發，切勿幹片。

17 加第四種一抗：在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放於(yu) 濕盒內(nei) 4°C孵育過夜。（濕盒內(nei) 加少量水防止抗體(ti) 蒸發）

18 加594標記的二抗：玻片置於(yu) PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩幹後在圈內(nei) 滴加與(yu) 一抗相應種屬的594標記的熒光二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50min。孵育完後，玻片置於(yu) PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

19 DAPI複染細胞核：切片稍甩幹後在圈內(nei) 滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。

20 自發熒光淬滅：切片稍甩幹後，在圈內(nei) 加入自發熒光淬滅劑5min，流水衝(chong) 洗10min。

21 封片：玻片置於(yu) PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩幹後用抗熒光淬滅封片劑封片。

22 鏡檢成像：切片置於(yu) 掃描儀(yi) 下采集圖像。（DAPI紫外激發波長330-380nm，發射波長420nm，發藍光；FITC激發波長465-495nm，發射波長515-555 nm，發綠光；CY3激發波長510-560，發射波長590nm，發紅光. 647熒光激發波長 608-648nm, 發射波長672-712,，原本為(wei) 正紅色，為(wei) 了與(yu) CY3區分開，我們(men) 設定為(wei) 粉色光。 594激發波長594nm，發射波長615nm. 我們(men) 設定為(wei) 紫紅色。

技術原理介紹：

主要原理是基於(yu) 酪胺信號放大（TSA，Tyramide signal amplification），以下簡稱TSA技術。TSA是一種基於(yu) 辣根過氧化物酶HRP的催化活性對靶蛋白或核酸進行高密度原位標記的酶學檢測方法。技術主要原理為(wei) 熒光標記的酪胺在HRP與(yu) H2O2的作用下變為(wei) 活化的酪胺，附著在靶標周圍的蛋白酪-氨酸殘基上。此結合是共價(jia) 結合，而一抗與(yu) 靶標、二抗與(yu) 一抗之間是非共價(jia) 結合，通過微波修複處理，第一輪的一抗二抗被洗脫，熒光標記的酪胺依然附著在靶標周圍。在檢測第二個(ge) 靶標時，相當於(yu) 全新的一輪標記，無需考慮第二輪的抗體(ti) 是否與(yu) 第一輪的抗體(ti) 產(chan) 生交叉反應。隻需變化不同熒光標記即可實現多個(ge) 靶標的標記。通過多次重複免疫標記，使用不同的熒光酪胺實現雙重或多重熒光染色

送樣運輸要求：

　　1、樣本放置於(yu) 20倍樣本體(ti) 積的固定液中固定24h以上，常溫運輸送樣。

　　切勿固定時間過長，切勿冷凍結冰。

　　2、熒光四標隻能做石蠟包埋切片，不能做冰凍切片和細胞爬片。