熒光免疫染色實驗檢測

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• 熒光免疫染色實驗檢測

免疫熒光是一種將抗原、抗體(ti) 的結合反應與(yu) 形態學相結合的方法。該法把血清學的特異性、熒光色素的敏感性、顯微鏡檢查法集為(wei) 一體(ti) ，擴大了免疫學診斷的效果，是近代免疫學的一種重要研究手段。抗體(ti) 球蛋白標記上熒光色素，即成為(wei) 熒光抗體(ti) 。這是利用某些熒光色素在一定條件下可與(yu) 抗體(ti) 分子結合，但不影響抗體(ti) 的免疫活性。用熒光抗體(ti) 浸染可能含抗原的細胞或組織切片，如有相應抗原存在，則抗原與(yu) 標記抗體(ti) 特異性結合，形成的免疫複合物固定於(yu) 細胞上，不容易洗脫，在熒光顯微鏡下成為(wei) 發出熒光的可見物體(ti) ，可達到診斷及定位的目的。

• 熒光免疫染色實驗檢測，熒光免疫染色實驗原理

將不影響抗原抗體(ti) 活性的熒光色素標記在抗體(ti) （或抗原）上，與(yu) 其相應的抗原（或抗體(ti) ）結合後，在熒光顯微鏡下呈現一種特異性熒光反應。

免疫熒光細胞化學是根據抗原抗體(ti) 反應的原理，先將已知的抗原或抗體(ti) 標記上熒光素製成熒光標記物，再用這種熒光抗體(ti) （或抗原）作為(wei) 分子探針檢查細胞或組織內(nei) 的相應抗原（或抗體(ti) ）。在細胞或組織中形成的抗原抗體(ti) 複合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標本，熒光素受激發光的照射而發出明亮的熒光（黃綠色或桔紅色），可以看見熒光所在的細胞或組織，從(cong) 而確定抗原或抗體(ti) 的性質、定位，以及利用定量技術測定含量。

三、，實驗流程

免疫熒光單標記方法

免疫熒光單標記是指隻標記一種蛋白質分子，方法比較簡單，隻要按照染色步驟去做，通常不存在太多的問題。但要注意固定液的選擇，固定液選擇的合適與(yu) 否，可能會(hui) 直接影響染色結果。具體(ti) 染色方法如下。

1、所需材料與(yu) 試劑

a, 培養(yang) 在蓋玻片或玻璃培養(yang) 皿中融合程度達到60%-70%的細胞。

b, 一抗、FITC或TRITC標記的二抗。

c, 4%多聚甲醛固定液或冷丙酮固定液 (-20℃預冷20 min)。

d, 封閉液。

e, 0.01mol／LPBS緩衝(chong) 液。

2、染色方法

a, 取出培養(yang) 有細胞的蓋玻片或glass-bottom培養(yang) 皿，用0.01MPBS洗2-3遍。

b, 加入0.3%的Tritonx-100, 37℃, 30 rain

c, 加入4%多聚甲醛試問固定30 min或冷丙酮4℃固定10 min。

d，正常阻斷血清1:20封閉試問20-30 min，抑製IgG的非特異性結合。阻斷血清必須選擇與(yu) 二抗同一種屬的正常血清。

e, 去掉正常血清，直接加入一抗，37℃孵育1 h或4℃過夜。抗體(ti) 以0.01 mo/LPBS稀釋(理想的抗體(ti) 濃度需經試驗而定)。

f, 0.3% TritonX-100洗5 min，0.01 mol/IPBS洗5 min，0.3% TritonX 5 min，0.01 M PBS洗5 rain。

g, 加入FITC-二抗或TRITC-二抗，37℃，孵育1h。

h, 0.3%TritonX-100洗5rain，0.01 mol/LPBS洗5min，0.3% Triton X 5min，0.01mol/LPBS洗5 min，用濾紙吸幹。

i, 90%甘油(PBS配製)封片。

j, 激光掃描共焦顯微鏡下觀察，或於(yu) 4℃避光保存。

免疫熒光雙標記方法

免疫熒光的雙標記是指同時標記細胞內(nei) 兩(liang) 種蛋白質分子，當懷疑某種配體(ti) 與(yu) 已知受體(ti) 結合後可用此方法加以證明。此方法稍微複雜一些，首先應注意所用的一抗必須是來自不同種屬動物的兩(liang) 種特異性抗體(ti) (例如：A抗體(ti) 為(wei) 多克隆抗體(ti) ，來自家兔；B抗體(ti) 為(wei) 單克隆抗體(ti) ，來自小鼠)。其次，兩(liang) 種二抗所帶熒光素的發射光不應重疊，且盡量遠離，通常可以選擇FITC和TRITC、Alex488和TRITC、FITC和Cy5，或Cy3和Cy5等來組合。通常情況下，染色時兩(liang) 種一抗可以同時孵育，然後可以同時孵育兩(liang) 種二抗。但當染色結果一種顏色非常弱，而另一種顏色比較強時，應考慮先孵育顏色較弱的二抗。其他步驟同免疫熒光單標記。

四、客戶提供

細胞株或細胞爬片。（注：細胞爬片不宜太密；細胞必須固定。）組織切片，一抗

五、公司提供

實驗步驟、實驗試劑、樣品處理、圖片及圖片分析，熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡拍攝

熒光免疫染色