亞氨基二乙酸-瓊脂糖

亞(ya) 氨基二乙酸-瓊脂糖

1 、產(chan) 品介紹

IDA NUPharose HP 是含亞(ya) 氨基二乙酸（iminodiacetic acid，IDA）基團的金屬螯合填料，適用於(yu) 大部分帶組-氨酸標簽（His-tag）蛋白的親(qin) 和層析。，HP為(wei) High Performance的縮寫(xie) ，意為(wei) 高分辨，微球的平均粒徑為(wei) ~35μm。IDANUPharose HP未螯合金屬離子，用戶可螯合Ni2+、Co2+、Cu2+、Zn2+ 等金屬離子後使用。

通過獨-特的配基修飾工藝，這款產(chan) 品做到了親(qin) 和力和特異性的平衡：對大部分帶組-氨酸標簽蛋白的結合量大於(yu) 50 mg/mL的同時，一步純化後樣品純度可達90%以上。

2 、產(chan) 品特點與(yu) 技術指標

注：a90%體(ti) 積以上的微球在此粒徑範圍；bDBC10%測試條件為(wei) ：10%流穿，大腸杆菌表達帶組-氨酸標簽的重組金黃色-葡萄球菌蛋白A，6 min 停留時間；c 10 cm 柱高下的最大測試流速；d 未螯合金屬離子狀態下的pH 穩定性。

 3 、金屬螯合親(qin) 和層析——IDA

金屬螯合親(qin) 和層析是基於(yu) 蛋白質分子表麵的組氨-酸的咪唑基、半胱-氨酸的巰基和色-氨酸吲哚基能與(yu) Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+等金屬離子形成穩定的配位結合而進行生物大分子分離純化的過程。其中，以Ni2+為(wei) 螯合離子來純化6個(ge) 或更多組-氨酸組成的Hig-tag標簽蛋白最為(wei) 常見，本說明書(shu) 也以該體(ti) 係為(wei) 例簡要闡述IDA NUPharose HP的親(qin) 和原理（圖 1）。

NUPharose基球修飾上IDA配基後，該配體(ti) 擁有三個(ge) 配位基團，其中一個(ge) 氮原子和兩(liang) 個(ge) 氧原子可以與(yu) Ni2+形成牢固的螯合物。Ni2+可形成6配位數的八麵體(ti) 結構，剩餘(yu) 的三個(ge) 自由配位點可以與(yu) 溶劑分子或蛋白質分子結合。Ni2+與(yu) 組-氨酸標簽蛋白的組-氨酸殘基的咪唑基團配位結合的過程即為(wei) 金屬螯合填料與(yu) 目標蛋白的特異性結合過程。提高緩衝(chong) 液中咪唑的濃度可以將目標蛋白洗脫，洗脫過程中咪唑和目標蛋白競爭(zheng) 與(yu) Ni2+的結合。降低pH會(hui) 影響金屬離子與(yu) 配體(ti) 的結合，因此改變pH也是金屬螯合層析洗脫過程的方式之一，但pH不宜低於(yu) 4，pH過低會(hui) 將剝離金屬離子。通常也用pH4的醋酸鈉緩衝(chong) 液清洗螯合Ni2+後的填料，以除去未穩定螯合的Ni2+。

金屬離子親(qin) 和層析過程的非特異性吸附可能來自離子相互作用、金屬離子與(yu) 含組-氨酸、半胱-氨酸、色-氨酸的雜蛋白之間的相互作用。前者通過提高緩衝(chong) 液的離子強度得到抑製，通常添加500mM的NaCl；後者可在上樣緩衝(chong) 液中添加少量的咪唑（例如~5mM）或者在衝(chong) 洗過程中添加咪唑而除去。經過優(you) 化，可以得到樣品純度和收率均較高的結果。Ni-IDA NUPharose HP填料在使用過程中Ni2+脫落量少，可連續使用多次。當填料性能明顯下降後可以用EDTA將原金屬離子剝離，重新螯合鎳後再生使用。不同金屬離子對目標蛋白的親(qin) 和力與(yu) 特異性不同，Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+的親(qin) 和力依次降低（影響產(chan) 率），特異性依次升高（影響純度），可根據分離需求選定合適的金屬離子。對於(yu) 大多帶Hig-tag標簽的重組蛋白，Ni2+通常是首先考慮的金屬離子，建議使用螯合Ni2+的Ni-IDANUPharose HP。對於(yu) 含組-氨酸、半胱-氨酸或色-氨酸的非標簽蛋白，Cu2+的高親(qin) 和力有利於(yu) 結合目標蛋白。對於(yu) 磷蛋白，可考慮使用四價(jia) 或者三價(jia) 離子。值得注意的是，上述規律不總是成立，需根據目標蛋白篩選合適的金屬離子。

4 、使用方法參考

 4.1  色譜柱裝填

以下闡述與(yu) 層析係統連接時，填料的色譜柱裝填方法。

（1）所有需要用到的材料的溫度要與(yu) 色譜操作的溫度一樣，液體(ti) 最好做脫氣處理。

（2）填料用量計算：通過沉降定量填料體(ti) 積，需要的沉降填料體(ti) 積=柱體(ti) 積×壓縮比（也稱壓縮因子）。沉降體(ti) 積是指填料在20%乙醇保存液中自然沉降完-全讀取的穩定體(ti) 積。IDANUPharose HP 的壓縮比為(wei) ~1.20。為(wei) 使達到裝柱比，可通過柱頭下壓的方法，也可以通過高流速壓柱。

（3）填料清洗：將填料懸液充分搖勻後量取相應體(ti) 積，抽濾除去液體(ti) ，並用約3倍填料體(ti) 積的純化水洗滌，重複3次，以除去保存液。

（4）裝柱填料懸液準備：將填料轉移到適當的容器中，加入適量的裝柱液，製成50~75 v%的裝柱填料懸液，使用前攪勻。

（5）裝填前準備：在清洗幹淨的層析柱下端加入裝柱液，以除去下墊片及層析柱下 端的空氣，在柱內(nei) 保留少量的蒸餾水，擰緊下堵頭，調整柱子使其垂直於(yu) 地麵。

（6）裝填：將攪勻後的填料懸液一次性緩慢倒入層析柱內(nei) （必要時使用裝柱器）， 為(wei) 避免引入氣泡，應使之沿層析柱內(nei) 壁自然流下。將所有填料加入後， 用裝柱液將裝柱 器加滿，擰緊裝柱器上蓋，將柱子與(yu) 層析係統連接。

（7）壓柱：使柱內(nei) 填料自然沉降（或50~150 cm/h的低流速下沉降），待填料沉降完-全後（填料與(yu) 液體(ti) 的界麵清晰），去除裝柱器，裝上上柱頭，並將柱頭下降至界麵處；通過高流速（推薦流速見下表，注意柱壓不超過0.3MPa），繼續壓柱至界麵清晰穩定，標記界麵穩定時的柱高。停泵，打開柱頭上的閥門/堵頭，關(guan) 閉柱底的閥門/堵頭，下壓柱頭至標記位置下方與(yu) 壓縮比對應的位置，旋緊柱頭，裝柱完成。裝柱完成後，需用高流速平衡柱內(nei) 的填料。

4.2  柱效測定和評價(jia)

完成裝柱後、使用前可通過柱效測定和評價(jia) 可以確認層析柱裝填質量。柱效通常用理論塔板高度（HETP）和非對稱因子（As）來評價(jia) 。

4.3  螯合金屬離子

IDA NUPharose HP 以未螯合金屬離子的形式出售，用戶可以在裝柱完成後再層析柱中螯合金屬離子，螯合過程參照以下步驟。

（1）配製50~200 mM的金屬離子溶液，例如螯合Ni2+通常用NiSO4。螯合Ni2+、 Cu2+、Co2+、Zn2+等不同離子的過程基本相同，需注意控製不同pH條件下不同金屬離子的溶解性，pH過高可導致沉澱。螯合Zn2+時，需控製pH=5.5或者更低；螯合Fe3+時，需控製pH=3.0左右。

（2）用純水清洗色譜柱，純水用量 3~5 CV（柱體(ti) 積），流速100~200cm/h。

（3）用0.2~0.8 CV 的金屬離子溶液通過色譜柱，流速50~100 cm/h金屬離子過量50%時足夠螯合完-全。例如 IDANUPharose HP可螯合18 μmol Ni2+/mL，用0.6 CV的50mM NiSO4溶液螯合時，Ni2+過量67%。螯合完-全後色譜柱底部的顏色從(cong) 白色變為(wei) 螯合特定金屬離子的顏色。

（4）用純水清洗色譜柱除去過量的金屬離子，純水用量至少5CV，流速100~200cm/h。

（5）用20mM醋酸鈉+0.5M NaCl（pH=4.0）緩衝(chong) 液將螯合不穩定的金屬離子除去，緩衝(chong) 液用量至少5 CV，流速100~200 cm/h。

（6）可直接用結合緩衝(chong) 液平衡色譜柱。

在裝柱前螯合金屬離子的過程與(yu) 上述在色譜柱中螯合一致，可在旋勻儀(yi) 、反應瓶（釜）中螯合金屬離子，利用過濾器清洗螯合前後的填料。

4.4 平衡與(yu) 上樣（Equilibration & Loading）

金屬螯合填料與(yu) 磷酸鹽、Tris-HCl等緩衝(chong) 體(ti) 係兼容，其中“20mM PB+500mM NaCl（pH=7.4）"的緩衝(chong) 體(ti) 係最為(wei) 常用。初始的緩衝(chong) 液稱為(wei) 平衡緩衝(chong) 液，記為(wei) 緩衝(chong) 液A。緩衝(chong) 液A的特點為(wei) 不含或者含少量咪唑，pH在7~8之間居多，呈弱堿性。實際使用過程中，如果上樣料液的體(ti) 積特別大，從(cong) 降低成本的角度考慮，可不往料液中添加咪唑和NaCl來抑製非特異性吸附，而是在上樣後進行衝(chong) 洗來去除雜質。

在上樣前，需用緩衝(chong) 液A在操作流速下平衡層析柱，該過程通常需要5~10個(ge) 柱體(ti) 積的緩衝(chong) 液A，以電導、pH等檢測信號參數不變且與(yu) 緩衝(chong) 液A對應為(wei) 準。

上樣量可按“mg目標蛋白/mL 填料"來設定，通常為(wei) DBC10%的50~80%，例如Ni-IDANUPharose HP產(chan) 品對重組金黃色-葡萄球菌蛋白A（r-SPA，NRPA04）的DBC10%為(wei) ~50mg/mL，純化 r-SPA 時的上樣量可為(wei) 25~4mg/mL。除了DBC10%，也可以測試上樣流穿液中的目標蛋白確定上樣量。上樣前需要對樣品進行離心（10000g 以 上）或/和過濾（0.22或0.45μm）等澄清處理，以免堵塞色譜柱。樣品的pH和鹽濃度可用緩衝(chong) 液A或濃度更高的母液調節。

上樣後需要3~10個(ge) 柱體(ti) 積的緩衝(chong) 液A再平衡層析柱

4.5  洗雜（Wash）

在緩衝(chong) 液A中添加5~40mM的咪唑衝(chong) 洗層析柱，可以將非特異性結合的雜蛋白除去。咪唑濃度越高，雜蛋白被除去得越徹-底，但會(hui) 降低目標蛋白的收率。洗雜過程咪唑的濃度與(yu) 不同蛋白的特性相關(guan) ，可通過階躍洗雜過程（例如5mM、10mM、20 mM……）快速優(you) 化洗雜條件。洗雜的體(ti) 積通常為(wei) 3~10個(ge) 柱體(ti) 積。

4.6 洗脫（Elution）

最-常用的洗脫方式為(wei) 提高洗脫液中咪唑的濃度（在緩衝(chong) 液A中加入咪唑），推薦在0~500mM範圍內(nei) 進行階躍洗脫或者線性梯度洗脫。對於(yu) 大多數帶組-氨酸標簽的蛋白，200mM的咪唑濃度可以將目標蛋白洗脫完-全。對於(yu) 一些場合，也可以改變pH，結合較弱的蛋白可在pH6時可洗脫，結合較強的蛋白可在pH6~4時洗脫，需注意pH不能低於(yu) 4。

4.7 再生（Regeneration）

在多次使用後，需要對填料進行再生。可以選擇0.5~1柱體(ti) 積200mM EDTA+500 mM NaCl（pH=7）的緩衝(chong) 液將金屬離子剝離。再用50~200mM的金屬鹽溶液與(yu) IDA配基螯合，用純水將過量的金屬離子除去，用20 mM醋酸鈉+0.5 M NaCl（pH=4.0）緩衝(chong) 液將螯合不穩定的金屬離子除去。金屬離子的重新螯合參照4.3小節。

4.8  在位清洗（CIP）

通常上述的再生過程可將填料徹-底清洗。若發生柱壓升高，或為(wei) 了避免交叉汙染，將金屬離子剝離後可進行在位清洗過程。可采用以下溶劑進行在位清洗：2mol/L NaCl ，1mol/L NaOH、70%乙醇或 30%異丙醇等。在位清洗可有效去除介質上的雜質，反向效果更佳。清洗後需用3~5 柱體(ti) 積的純水除去上述溶劑。

4.9 填料保存

填料的初始保存液為(wei) 20%乙醇，使用過後可繼續用20%乙醇保存。保存溫度在2~30 ℃為(wei) 宜，不可凍存。