3-氨基苯硼酸-瓊脂糖

3-氨基苯硼酸-瓊脂糖

1 、產(chan) 品介紹

NuPerley Boronate填料是在新一代高剛性瓊脂糖凝膠微球骨架的表麵設計特定的間隔臂後，再偶聯3-氨基苯硼酸形成的親(qin) 和層析介質。苯硼酸配基在弱堿性條件下可與(yu) 1,2-順式二醇通過可逆共價(jia) 鍵形成硼酸酯，可特異性結合含1,2-順式二醇結構的物質，包括糖蛋白（包括抗體(ti) ）、酶、多糖、核苷、核苷酸和兒(er) 茶酚等多類生物分子。也可通過NADP+或ATP來輔助分離純化不能直接與(yu) 填料結合的目標分子。因特異性高，且用途廣泛，使用本產(chan) 品的純化過程可單獨歸類為(wei) 硼酸親(qin) 和層析（Boronate affinity chromatography，BAC）。

2 、產(chan) 品特點與(yu) 技術指標

注：a90%體(ti) 積以上的微球在此粒徑範圍；b 10 cm 柱高下的最大測試流速。

3、硼酸親(qin) 和原理

NuPerley Boronate與(yu) 1,2-順式二醇結構形成的可逆共價(jia) 鍵（硼酸酯）是層析過程的主要作用力（圖 1）。pH=8.5 以上有利於(yu) 填料與(yu) 目標分子以硼酸酯的形式結合，但生物分子的分離純化較少用到pH=9.0以上的條件；pH=4.0~6.0則有利於(yu) 硼酸酯的解離。除了可以降低pH將目標分子洗脫，也可以用山梨-醇、甘露-醇等含1,2-順式二醇結構的糖 類進行競爭(zheng) 洗脫。

除了可逆共價(jia) 鍵，配基中存在苯環這一疏水基團，可能與(yu) 含苯環的物質之間存在π-π相互作用，這要求上樣緩衝(chong) 液的離子強度不能過高，通常在~50mM，以降低疏水相互作用造成的非特異性吸附。硼酸酯的四麵體(ti) 結構帶負電荷，為(wei) 降低離子相互作用造成的非特異性吸附，又要求結合過程有較高的離子強度。NuPerley Boronate 通常在50~500mM的離子強度下與(yu) 目標分子有較優(you) 的特異性結合。二價(jia) 陽離子可降低離子相互作用和疏水相互作用造成的非特異性吸附，例如可在上樣緩衝(chong) 液中加入0~50mM的MgCl2。Mg2+也可以抑製填料與(yu) 核酸等含磷酸基團物質的電荷互斥作用，加入Mg2+可以增強結合效果。

當形成的硼酸酯以不帶電荷的平麵三角形結構存在時，硼原子存在空軌道，可作為(wei) 電荷轉移相互作用的電子受體(ti) 。未質子化的氨基是良好的電子供體(ti) ，當氨基提供孤對電子給硼原子時，硼原子形成四麵體(ti) 型，促進硼酸酯的形成。但需要注意的是，當氨基附近有羥基存在時，填料與(yu) 1,2-順式二醇將無法形成硼酸酯結構。這也是為(wei) 什麽(me) 乙醇胺和Tris不適合作為(wei) NuPerley Boronate的上樣緩衝(chong) 液。

4 、使用方法參考

4.1  色譜柱裝填

以下闡述與(yu) 層析係統連接時，填料的色譜柱裝填方法。

（1）所有需要用到的材料的溫度要與(yu) 色譜操作的溫度一樣，液體(ti) 最好做脫氣處理。

（2）填料用量計算：通過沉降定量填料體(ti) 積，需要的沉降填料體(ti) 積=柱體(ti) 積×壓縮比（也稱壓縮因子）。沉降體(ti) 積是指填料在20%乙醇保存液中自然沉降完-全讀取的穩定體(ti) 積。NuPerley Boronate的壓縮比為(wei) ~1.10。為(wei) 使達到裝柱比，可通過柱頭下壓的方法，也可以通過高流速壓柱。

（3）填料清洗：將填料懸液充分搖勻後量取相應體(ti) 積，抽去液體(ti) ，並用約3倍填料體(ti) 積的純化水洗滌，重複3次，以除去保存液。

（4）裝柱填料懸液準備：將填料轉移到適當的容器中，加入適量的裝柱液，製成50~75 v%的裝柱填料懸液（原包裝中填料體(ti) 積分數為(wei) 67%），使用前攪勻。

（5）裝填前準備：在清洗幹淨的層析柱下端加入裝柱液，以除去下墊片及層析柱下 端的空氣，在柱內(nei) 保留少量的蒸餾水，擰緊下堵頭，調整柱子使其垂直於(yu) 地麵。

（6）裝填：將攪勻後的填料懸液一次性緩慢倒入層析柱內(nei) （必要時使用裝柱器），為(wei) 避免引入氣泡，應使之沿層析柱內(nei) 壁自然流下。將所有填料加入後，用裝柱液將裝柱 器加滿，擰緊裝柱器上蓋，將柱子與(yu) 層析係統連接。

（7）壓柱：使柱內(nei) 填料自然沉降（或50~150 cm/h 的低流速下沉降），待填料沉降完-全後（填料與(yu) 液體(ti) 的界麵清晰），去除裝柱器，裝上上柱頭，並將柱頭下降至界麵處；通過高流速（推薦流速見下表，注意柱壓不超過0.3MPa），繼續壓柱至界麵清晰穩定，標記界麵穩定時的柱高。停泵，打開柱頭上的閥門/堵頭，關(guan) 閉柱底的閥門/堵頭，下壓柱頭至標記位置下方與(yu) 壓縮比對應的位置，旋緊柱頭，裝柱完成。裝柱完成後，需用高流速平衡柱內(nei) 的填料。

4.2  柱效測定和評價(jia)

完成裝柱後、使用前可通過柱效測定和評價(jia) 可以確認層析柱裝填質量。柱效通常用理論塔板高度（HETP）和非對稱因子（As）來評價(jia) 。

4.3  平衡與(yu) 上樣

在上樣前，可用上樣緩衝(chong) 液（平衡緩衝(chong) 液）在操作流速下平衡層析柱，觀察檢測器的變化，直到電導、pH 等參數不變。上樣量根據樣品的性質和層析介質的量進行選擇，可在預實驗中確定，例如靜態吸附實驗。一般需要將樣品用上樣緩衝(chong) 液稀釋，例如1：1稀釋。

上樣緩衝(chong) 液pH通常為(wei) 8.5~9.0，例如將糖蛋白從(cong) 非糖蛋白中分離可用HEPES緩衝(chong) 液（20mM HEPES, 20mMMgCl2,pH 8.5），從(cong) 脫氧核糖核苷中分離核糖核苷可用醋酸銨緩衝(chong) 液（0.25 M 醋酸銨, pH 8.8）。本填料常用的上樣緩衝(chong) 體(ti) 係有磷酸鹽、醋酸銨、HEPES等，一般情況下應避免使用含氨基的緩衝(chong) 液，例如 Tris-HCl體(ti) 係。

4.4 洗脫

用2-3個(ge) 柱體(ti) 積的平衡緩衝(chong) 液衝(chong) 洗上樣後的層析柱，觀察檢測器的變化，直到電導、pH等參數不變，此時未結合的組分被清洗出去。

親(qin) 和層析柱的洗脫可用恒定洗脫、梯度洗脫或者階躍洗脫。洗脫過程可以將pH降低至4~6，例如0.1M 甲酸、25mM鹽酸；也可以選擇糖類進行競爭(zheng) 洗脫，如10~200mM山梨-醇；也可以用0~20 mM的EDTA；Tris可作為(wei) 高效洗脫劑。

4.5  再生與(yu) 在位清洗（CIP）

通常可用5 C 的洗脫液將填料再生。若有失活蛋白質或脂類物質在再生時洗不掉可用在位清洗（CIP）除去。可采用以下選擇進行在位清洗：0.5mol/LNaOH、70%乙醇、30%異丙醇等。在位清洗可有效去除介質上的雜質，反向效果更佳。

4.6 填料保存

填料的初始保存液為(wei) 20%乙醇，使用過後可繼續用20%乙醇保存。也可以用0.2 M醋酸鈉、0.1M甲酸等與(yu) 洗脫、再生接近的緩衝(chong) 液保存，緩衝(chong) 液中可添加0.02%疊氮-化鈉以防腐，在偏弱酸性的環境中填料更穩定。保存溫度在2~8 ℃為(wei) 宜，不可凍存。

3-氨基苯硼酸-瓊脂糖