瓊脂糖-易洗脫重組鏈球菌蛋白G親和填料

瓊脂糖-易洗脫重組鏈球菌蛋白G親(qin) 和填料

1 、產(chan) 品介紹

ee-ProGNUPharose FF是一款易洗脫的抗體(ti) 親(qin) 和填料，ee為(wei) Easy Elution的縮寫(xie) ，意味該填料較傳(chuan) 統的蛋白G填料更容易洗脫，即洗脫的pH更高，FF為(wei) Fast Flow的縮寫(xie) ，意味該填料可在高流速下工作。

易洗脫重組鏈球菌蛋白G配基由大腸杆菌表達，不含動物來源。ee-ProGNUPharose FF的基球與(yu) 配基通過單點偶聯而成，加之對結合域的基因工程改造，其對h-IgG的動態結合載量高於(yu) 40mg/mL，pH=4~5的條件可以將h-IgG較好的洗脫，較市麵的蛋白G填料產(chan) 品有載量高和易洗脫兩(liang) 大優(you) 勢。與(yu) 蛋白A填料相比，蛋白G填料的優(you) 勢在於(yu) 可以與(yu) 人類和小鼠所有IgG亞(ya) 型結合。本產(chan) 品對人、小鼠、大鼠、兔、牛等等來源的多種類 型和亞(ya) 型的抗體(ti) 有親(qin) 和作用，可從(cong) 腹水、血清、細胞培養(yang) 上清或細胞抽提物中分離和純化多種哺乳動物不同亞(ya) 型的抗體(ti) 或包含抗體(ti) Fc片段的基因工程重組蛋白，可滿足不同規模的研究或生產(chan) 需求。

2 、產(chan) 品特點與(yu) 技術指標

注：a90%體(ti) 積以上的微球在此粒徑範圍；bDBC10%測試條件為(wei) ：10%流穿，6 min 停留時間；c 推薦流速是指該流速可滿足大部分柱高下2~6 min停留時間的使用條件，並非隻能在該流速範圍內(nei) 工作；d 10 cm 柱高下的最大測試流速。

3、抗體(ti) 親(qin) 和層析簡介——易洗脫重組鏈球菌蛋白 G

ee-ProG NUPharose FF 的配基為(wei) 重組鏈球菌蛋白G，與(yu) 金黃色-葡萄球菌蛋白A一樣，其與(yu) IgG之間的親(qin) 和作用也主要通過蛋白G結合域與(yu) Fc區之間的相互作用。在基因工程改造過程中，將鏈球菌蛋白G的白蛋白結合域去除，使得該配基與(yu) 目標分子的特異性結合增強。野生型蛋白G的不同結合域對IgG的親(qin) 和力不同，本產(chan) 品的配基選取了親(qin) 和力較弱的結合域並對之加以基因工程改造，達到了易洗脫的目的。蛋白A與(yu) IgG之間的親(qin) 和作用包括在IgG生理條件的溶液狀態下的疏水相互作用、極性相互作用和氫鍵，蛋白G與(yu) IgG之間的親(qin) 和作用是以疏水相互作用為(wei) 主。一般需要降低pH將親(qin) 和作用破壞後進行洗脫，例如pH=3的甘-氨酸、檸檬酸鹽和乙酸鹽等。對於(yu) 本產(chan) 品，pH=4~5的條件可以將IgG較好的洗脫，比市麵上常見的蛋白G填料的洗脫pH高1個(ge) 單位左右。下表為(wei) 蛋白A和蛋白G對不同哺乳動物不同亞(ya) 型抗體(ti) 的結合情況。注：-表示不結合；+表示微弱結合；++表示中等結合4.5 在位清洗（CIP）

若發生柱；+++表示很強結合。

4 、使用方法參考 

4.1  色譜柱裝填

以下闡述與(yu) 層析係統連接時，填料的色譜柱裝填方法。

（1）所有需要用到的材料的溫度要與(yu) 色譜操作的溫度一樣，液體(ti) 最好做脫氣處理。

（2）填料用量計算：通過沉降定量填料體(ti) 積，需要的沉降填料體(ti) 積=柱體(ti) 積×壓縮 比（也稱壓縮因子）。沉降體(ti) 積是指填料在20%乙醇保存液中自然沉降完-全讀取的穩定體(ti) 積。ee-ProGNUPharose FF的壓縮比為(wei) 1.15。為(wei) 使達到裝柱比，可通過柱頭下壓的方法，也可以通過高流速壓柱。

（3）填料清洗：將填料懸液充分搖勻後量取相應體(ti) 積，抽濾除去液體(ti) ，並用約3倍填料體(ti) 積的純化水洗滌，重複3次，以除去保存液。

（4）裝柱填料懸液準備：將填料轉移到適當的容器中，加入適量的裝柱液，製成50~75 v%的裝柱填料懸液，使用前攪勻。

（5）裝填前準備：在清洗幹淨的層析柱下端加入裝柱液，以除去下墊片及層析柱下端的空氣，在柱內(nei) 保留少量的蒸餾水，擰緊下堵頭，調整柱子使其垂直於(yu) 地麵。

（6）裝填：將攪勻後的填料懸液一次性緩慢倒入層析柱內(nei) （必要時使用裝柱器），為(wei) 避免引入氣泡，應使之沿層析柱內(nei) 壁自然流下。將所有填料加入後，用裝柱液將裝柱器加滿，擰緊裝柱器上蓋，將柱子與(yu) 層析係統連接。

（7）壓柱：使柱內(nei) 填料自然沉降（或50~150 cm/h的低流速下沉降），待填料沉降完-全後（填料與(yu) 液體(ti) 的界麵清晰），去除裝柱器，裝上上柱頭，並將柱頭下降至界麵處；通過高流速（推薦流速見下表，注意柱壓不超過0.3MPa），繼續壓柱至界麵清晰穩定，標記界麵穩定時的柱高。停泵，打開柱頭上的閥門/堵頭，關(guan) 閉柱底的閥門/堵頭，下壓柱頭至標記位置下方與(yu) 壓縮比對應的位置，旋緊柱頭，裝柱完成。裝柱完成後，需用高流速平衡柱內(nei) 的填料。

4.2 柱效測定和評價(jia)

完成裝柱後、使用前可通過柱效測定和評價(jia) 可以確認層析柱裝填質量。柱效通常用理論塔板高度（HETP）和非對稱因子（As）來評價(jia) 。

柱效測定可以采用丙酮或者NaCl作為(wei) 樣品進行，按照下表配製樣品溶液和流動相。 

根據UV或者電導率曲線計算理論塔板高度（HETP）、理論塔板數（N）和非對稱因子（As），公式如下：

HETP=L/N

N=5.54(VR/Wh)2 As=a/b

其中：L為(wei) 柱高；VR為(wei) 保留體(ti) 積；Wh 為(wei) 半高峰寬；a為(wei) 在10%峰高處的第一個(ge) 半峰寬；b為(wei) 在10%峰高處的第二個(ge) 半峰寬。

一般來說，HETP的數值應小於(yu) 填料平均粒徑的三倍（即HETP/D50<3，D50為(wei) 填 料的平均粒徑），As應在0.8~1.5之間。

4.3 平衡與(yu) 上樣（Equilibration & Loading）

PB緩衝(chong) 液（20mM PB+150 mM NaCl，pH=7.0~7.4）是較為(wei) 常用和通用的緩衝(chong) 體(ti) 係。初始的緩衝(chong) 液稱為(wei) 平衡緩衝(chong) 液，記為(wei) 緩衝(chong) 液A。有時也選擇不添加NaCl。

在上樣前，需用緩衝(chong) 液A在操作流速下平衡層析柱，該過程通常需要5~10個(ge) 柱體(ti) 積的緩衝(chong) 液A，以電導、pH 等檢測信號參數不變且與(yu) 緩衝(chong) 液A對應為(wei) 準。

上樣量可按“mg目標蛋白/mL填料"來設定，通常為(wei) DBC10%的50~80%，例如ee-ProGNUPharoseFF產(chan) 品對人IgG的DBC10%為(wei) ~40mg/mL上樣量可控製為(wei) 20~32 mg/mL。在條件篩選階段，也可以降低上樣品，觀察結合、特異性和洗脫情況。上樣前需要對樣品進行離心（10000 g以上）、過濾（0.22或0.45μm）處理，以免堵塞色譜柱。

上樣後需要3~10個(ge) 柱體(ti) 積的緩衝(chong) 液A再平衡層析柱。

4.4 洗脫與(yu) 再生（Elution & Regeneration）

一般的蛋白G填料，最-常用的洗脫方式為(wei) pH=3的甘-氨酸、檸檬酸鹽或乙酸鹽，蛋白G與(yu) 一些IgG之間的結合力更強，有時需要將pH降低至2.5才能完-全洗脫。但該pH較低，可能會(hui) 使一些抗體(ti) 失活或聚集。本產(chan) 品通常在pH=4~5時，IgG可被較好洗脫。

於(yu) 不同類型的IgG，最高的洗脫pH會(hui) 有差異。倘若pH=4~5對IgG仍太低，也可以將洗脫液收集在弱堿性的緩衝(chong) 液中，中和至中性，以縮短低pH條件的接觸時間。洗脫之後，可用5~10個(ge) 柱體(ti) 積的洗脫液對色譜柱進行再生。

4.5  在位清洗（CIP）

若發生柱壓升高，或有蛋白與(yu) 填料強烈結合無法洗脫，或有沉澱、變性蛋白時，需要對填料進行在位清洗，可采用以下方法去除雜質，反向清洗效果更佳。

4.6 填料保存

填料的初始保存液為(wei) 20%乙醇，使用過後可繼續用20%乙醇保存。保存溫度在2~8℃為(wei) 宜，不可凍存。