次氮基三乙酸-交聯瓊脂糖

次氮基三乙酸-交聯瓊脂糖

1 、產(chan) 品介紹

IMAC NUPharose HP是含次氮基三乙酸（NTA）基團的金屬螯合填料，主要用於(yu) 帶組氨-酸標簽（His-tag）蛋白的親(qin) 和層析。HP為(wei) High Performance的縮寫(xie) ，意為(wei) 高分辨，微球的平均粒徑為(wei) ~35μm。IMAC NUPharose HP未螯合金屬離子，用戶可螯合Ni2+、Co2+、Cu2+、Zn2+等金屬離子後使用，也提供螯合後可直接使用的填料及相應的預裝柱，螯合Ni2+的產(chan) 品為(wei) Ni-NTANUPharose HP。

通過配基修飾過程的優(you) 化，產(chan) 品做到了親(qin) 和力和特異性的平衡：對帶組氨-酸標簽蛋白的結合量大於(yu) 50 mg/mL的同時，一步純化後樣品純度可達90%以上。除了組-氨-酸，金屬螯合填料也可與(yu) 色-氨酸、半胱-氨酸殘基形成配位結合，因而這款填料也可用於(yu) 純化不帶標簽但含這些氨基酸殘基的蛋白，例如人脫鐵轉鐵蛋白。

與(yu) 亞(ya) 氨基二乙酸（IDA）配基相比，NTA配基的性能更加均衡，具有如下特點。

l 對螯合劑、還原劑、堿等試劑的耐受性更好。例如樣品中含有1mM EDTA、1~10 mM β-巰基乙醇或5 mM DTT時，可用Ni-NTANUPharose FF正常純化，純化後可用0.1~1 M NaOH清洗。

l 純化過程洗脫液中脫落的金屬離子可低至ppb（10-12）級，脫落的金屬離子相對於(yu) 目標蛋白的摩爾比可低於(yu)  0.1。

2 、產(chan) 品特點與(yu) 技術指標

注：a90%體(ti) 積以上的微球在此粒徑範圍；bDBC10%測試條件為(wei) ：10%流穿，大腸杆菌表達帶組-氨酸標簽的重組蛋白，6 min 停留時間；c 10 cm 柱高下的最大測試流速；d 剝離金屬離子後 CIP 過程的 pH 穩定性

表中為(wei) 幾款金屬螯合填料對各種溶液環境的耐受性測試（靜態結合載量測試結果），其中

√表示基本不影響或降低 5%以內(nei)

!表示略有影響，降低 15%以內(nei) ，可使用

!!表示有影響，降低 30%以內(nei) ，使用需注意

×表示影響大，降低 30~50%，不建議使用

××表示影響很大，降低 50%以上，無法使用

注：a 樣品中直接加入試劑，其中 20 mM TCEP 的影響原因是直接加 TCEP 對 pH 有較大影響， EDTA-2Na 的影響原因是剝離 Ni2+ ；b 填料用試劑處理至少 2 h，清洗後填料的性能。

 3 、金屬螯合親(qin) 和層析

金屬離子親(qin) 和層析是基於(yu) 蛋白質分子表麵的組氨-酸的咪唑基、半胱-氨酸的巰基和色-氨酸吲哚基能與(yu) Cu2+、Ni2+、Zn2 、Co2+和Ca2+形成穩定的配位結合而進行生物大分子分離純化的過程。其中，以Ni2+為(wei) 螯合離子來純化6個(ge) 組氨-酸組成的標簽蛋白最為(wei) 常見，本說明書(shu) 也以該體(ti) 係為(wei) 例簡要闡述次氮基三乙酸（NTA）基團的親(qin) 和原理（圖1）。

NUPharose基球修飾上NTA配基後，該配體(ti) 擁有四個(ge) 配位基團，其中一個(ge) 氮原子和三個(ge) 氧原子可以與(yu) Ni2+形成牢固的螯合物。Ni2+可形成6配位數的八麵體(ti) 結構，剩餘(yu) 的兩(liang) 個(ge) 自由配位點可以與(yu) 溶劑分子或蛋白質分子結合。Ni2+與(yu) 組氨-酸標簽蛋白的兩(liang) 個(ge) 組氨-酸殘基的咪唑基團配位結合的過程即為(wei) 金屬螯合填料與(yu) 目標蛋白的特異性結合過程。提高緩衝(chong) 液中咪唑的濃度可以將目標蛋白洗脫，洗脫過程中咪唑和目標蛋白競爭(zheng) 與(yu) Ni2+的結合。降低pH會(hui) 影響金屬離子與(yu) 配體(ti) 的結合，因此改變pH也是金屬螯合層析洗脫過程的方式之一，但pH不宜低 4，pH過低會(hui) 將剝離金屬離子。

金屬離子親(qin) 和層析過程的非特異性吸附可能會(hui) 來自離子相互作用、金屬離子與(yu) 含組氨-酸、半胱-氨酸、色-氨酸蛋白之間的相互作用。前者通過提高緩衝(chong) 液的離子強度得到抑製，通常添加500 mM的NaCl；後者可在上樣緩衝(chong) 液中添加少量的咪唑（例如~5mM）或者在衝(chong) 洗過程中添加咪唑而除去。經過優(you) 化，可以得到樣品純度和收率均較高的結果。

IMAC NUPharose HP填料在使用過程中金屬離子掉落量少，可連續使用多次。當填料性能明顯下降後可以用EDTA將原金屬離子剝離，重新螯合鎳後再生使用。

4 、使用方法參考 

4.1 色譜柱裝填

以下闡述與(yu) 層析係統連接時，填料的色譜柱裝填方法。

（1）所有需要用到的材料的溫度要與(yu) 色譜操作的溫度一樣，液體(ti) 最好做脫氣處理。

（2）填料用量計算：通過沉降定量填料體(ti) 積，需要的沉降填料體(ti) 積=柱體(ti) 積×壓縮比（也稱壓縮因子）。沉降體(ti) 積是指填料在20%乙醇保存液中自然沉降完-全讀取的穩定體(ti) 積。IMAC NUPharose HP和Ni-NTANUPharose HP的壓縮比為(wei) ~1.20。為(wei) 使達到壓縮比，可通過柱頭下壓的方法，也可以通過高流速壓柱。

（3）填料清洗：將填料懸液充分搖勻後量取相應體(ti) 積，抽去液體(ti) ，並用約3倍填料體(ti) 積的純化水洗滌，重複3次，以除去保存液。

（4）裝柱填料懸液準備：將填料轉移到適當的容器中，加入適量的裝柱液，製成50~75 v%的裝柱填料懸液（原包裝中填料體(ti) 積分數為(wei) 67%），使用前攪勻。