次氮基三乙酸-瓊脂糖

次氮基三乙酸-瓊脂糖

1 、產(chan) 品介紹

 Co-NTANUPharoseFF是含次氮基三乙酸（NTA）基團的金屬螯合填料，主要用於(yu) 帶組-氨酸標簽（His-tag）蛋白的親(qin) 和層析。

與(yu) 亞(ya) 氨基二乙酸（IDA）配基相比，NTA配基的性能更加均衡，對螯合劑、還原劑、堿等試劑的耐受性更好，純化過程洗脫液中脫落的金屬離子少。

2 、產(chan) 品特點與(yu) 技術指標

注：a90%體(ti) 積以上的微球在此粒徑範圍；bDBC10%測試條件為(wei) ：10%流穿，大腸杆菌表達 帶組-氨酸標簽的重組蛋白，6 min 停留時間；c 10 cm 柱高下的最 大測試流速。d 剝離金屬離子後 CIP 過程的 pH 穩定性。

3 、金屬螯合親(qin) 和層析——NTA

金屬離子親(qin) 和層析是基於(yu) 蛋白質分子表麵的組-氨酸的咪唑基、半胱-氨酸的巰基和色-氨酸吲哚基能與(yu) Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+和Ca2+形成穩定的配位結合而進行生物大分子分離純化的過程。不同金屬離子對目標蛋白的親(qin) 和力與(yu) 特異性不同，通常情況下，Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+的親(qin) 和力依次降低（影響產(chan) 率），特異性依次升高（影響純度），可根據分離需求選定合適的金屬離子。以下簡要闡述Co-NTANUPharoseFF的親(qin) 和原理（圖 1）。

NUPharose基球修飾上NTA配基後，該配體(ti) 擁有四個(ge) 配位基團，其中一個(ge) 氮原子和三個(ge) 氧原子可以與(yu) Co2+形成牢固的螯合物。Co2+可形成6配位數的八麵體(ti) 結構，剩餘(yu) 的兩(liang) 個(ge) 自由配位點可以與(yu) 溶劑分子或蛋白質分子結合。Co2+與(yu) 組-氨酸標簽蛋白的兩(liang) 個(ge) 組-氨酸殘基的咪唑基團配位結合的過程即為(wei) 金屬螯合填料與(yu) 目標蛋白的特異性結合過程。提高緩衝(chong) 液中咪唑的濃度可以將目標蛋白洗脫，洗脫過程中咪唑和目標蛋白競爭(zheng) 與(yu) Co2+的結合。降低pH會(hui) 影響金屬離子與(yu) 配體(ti) 的結合，因此改變pH也是金屬螯合層析洗脫過程的方式之一，但pH不宜低於(yu) 4，pH過低會(hui) 將剝離金屬離子。

金屬離子親(qin) 和層析過程的非特異性吸附可能會(hui) 來自離子相互作用、金屬離子與(yu) 含組-氨酸、半胱-氨酸、色-氨酸蛋白之間的相互作用。前者通過提高緩衝(chong) 液的離子強度得到抑製，通常添加500mM的NaCl；後者可在上樣緩衝(chong) 液中添加少量的咪唑（例如~5mM）或者在衝(chong) 洗過程中添加咪唑而除去。經過優(you) 化，可以得到樣品純度和收率均較高的結果。

Co-NTANUPharoseFF填料在使用過程中Co2+掉落量少，可連續使用多次。當填料性能明顯下降後可以用EDTA將原金屬離子剝離，重新螯合鎳後再生使用。

4 、使用方法參考

4.1  色譜柱裝填

以下闡述與(yu) 層析係統連接時，填料的色譜柱裝填方法。

（1）所有需要用到的材料的溫度要與(yu) 色譜操作的溫度一樣，液體(ti) 最好做脫氣處理。

（2）填料用量計算：通過沉降定量填料體(ti) 積，需要的沉降填料體(ti) 積=柱體(ti) 積×壓縮比（也稱壓縮因子）。沉降體(ti) 積是指填料在20%乙醇保存液中自然沉降完-全讀取的穩定體(ti) 積。Co-NTANUPharoseFF的壓縮比為(wei) 1.15。為(wei) 使達到壓縮比，可通過柱頭下壓的方法，也可以通過高流速壓柱。

（3）填料清洗：將填料懸液充分搖勻後量取相應體(ti) 積，抽去液體(ti) ，並用約3倍填料體(ti) 積的純化水洗滌，重複3次，以除去保存液。

（4）裝柱填料懸液準備：將填料轉移到適當的容器中，加入適量的裝柱液，製成50~75 v%的裝柱填料懸液（原包裝中填料體(ti) 積分數為(wei) 67%），使用前攪勻。

（5）裝填前準備：在清洗幹淨的層析柱下端加入裝柱液，以除去下墊片及層析柱下端的空氣，在柱內(nei) 保留少量的蒸餾水，擰緊下堵頭，調整柱子使其垂直於(yu) 地麵。

（6）裝填：將攪勻後的填料懸液一次性緩慢倒入層析柱內(nei) （必要時使用裝柱器），為(wei) 避免引入氣泡，應使之沿層析柱內(nei) 壁自然流下。將所有填料加入後，用裝柱液將裝柱 器加滿，擰緊裝柱器上蓋，將柱子與(yu) 層析係統連接。

（7）壓柱：使柱內(nei) 填料自然沉降（或50~150 cm/h的低流速下沉降），待填料沉降完-全後（填料與(yu) 液體(ti) 的界麵清晰），去除裝柱器，裝上上柱頭，並將柱頭下降至界麵處；通過高流速（推薦流速見下表，注意柱壓不超過0.3MPa），繼續壓柱至界麵清晰穩定，標記界麵穩定時的柱高。停泵，打開柱頭上的閥門/堵頭，關(guan) 閉柱底的閥門/堵頭，下壓柱頭至標記位置下方與(yu) 壓縮比對應的位置，旋緊柱頭，裝柱完成。裝柱完成後，需用高流速平衡柱內(nei) 的填料。

4.2  柱效測定和評價(jia)

完成裝柱後、使用前可通過柱效測定和評價(jia) 可以確認層析柱裝填質量。柱效通常用 理論塔板高度（HETP）和非對稱因子（As）來評價(jia) 。

4.3  螯合金屬離子

Co-NTANUPharoseFF 以預螯合金屬離子的形式出售，在必要時可將金屬離子剝離（參照4.7小節），重新螯合Co2+過程參照以下步驟。

（1）配製50 mM的CoCl2溶液。

（2）用純水清洗色譜柱，純水用量3~5CV（柱體(ti) 積），流速100~300 cm/h。

（3）用3~5CV的金屬離子溶液通過色譜柱，流速50~100cm/h ，螯合完-全後色譜柱底部的顏色從(cong) 白色變為(wei) Co2+的粉紅色。

（4）用純水清洗色譜柱除去過量的金屬離子，純水用量至少5CV，流速100~300cm/h。

（5）用0.3M的NaCl溶液將螯合不穩定的金屬離子除去，緩衝(chong) 液用量至少3 CV，流速100~300 cm/h。

（6）可直接用結合緩衝(chong) 液平衡色譜柱。

在裝柱前螯合金屬離子的過程與(yu) 上述在色譜柱中螯合一致，可在旋勻儀(yi) 、反應瓶（釜）中螯合金屬離子，1 CV的CoCl2溶液即可，利用過濾器清洗螯合前後的填料。

4.4  平衡與(yu) 上樣（Equilibration & Loading）

金屬螯合填料與(yu) 磷酸鹽、Tris-HCl等緩衝(chong) 體(ti) 係兼容，其中20mM PB+150~500 mM NaCl（pH=7.4）的體(ti) 係最為(wei) 常用。初始的緩衝(chong) 液稱為(wei) 平衡緩衝(chong) 液，記為(wei) 緩衝(chong) 液A。緩衝(chong) 液A通常不含咪唑（對於(yu) Ni-NTA NUPharose FF，可在樣品中添加5~40mM咪唑，這是兩(liang) 種填料的區別），pH在7~8之間居多，呈弱堿性。

在上樣前，需用緩衝(chong) 液A在操作流速下平衡層析柱，該過程通常需要5~10個(ge) 柱體(ti) 積的緩衝(chong) 液A，以電導、pH等檢測信號參數不變且與(yu) 緩衝(chong) 液A對應為(wei) 準。

上樣量可按“mg目標蛋白/mL填料"來設定，通常為(wei) DBC10%的50~80%，例如Co-NTANUPharoseFF產(chan) 品對重組金黃色-葡萄球菌蛋白A（r-SPA，NRPA04）的DBC10%為(wei) ~40mg/mL，純化r-SPA 時的上樣量可為(wei) 20~32mg/mL。除了DBC10%，也可以測試上樣流穿液中的目標蛋白確定上樣量。

上樣後需要3~10 個(ge) 柱體(ti) 積的緩衝(chong) 液A再平衡層析柱。

4.5  洗雜（Wash）

在緩衝(chong) 液A中添加5mM的咪唑衝(chong) 洗層析柱，可以將非特異性結合的雜蛋白除去。咪唑濃度越高，雜蛋白被除去得越徹-底，但會(hui) 降低目標蛋白的收率。洗雜過程咪唑的濃度與(yu) 不同蛋白的特性相關(guan) ，對於(yu) Co-NTANUPharose FF，通常5 mM的濃度可以將雜蛋白除去。洗雜的體(ti) 積通常為(wei) 3~10個(ge) 柱體(ti) 積。

4.6  洗脫（Elution）

最-常用的洗脫方式為(wei) 提高洗脫液中咪唑的濃度（在緩衝(chong) 液A中加入咪唑），推薦在0~200 mM範圍內(nei) 進行階躍洗脫或者線性梯度洗脫。對於(yu) 大多數帶組-氨酸標簽的蛋白，200mM的咪唑濃度可以將目標蛋白洗脫完-全。對於(yu) 一些場合，也可以改變pH，需注意pH不能低於(yu) 4。

4.7  再生（Regeneration）

在多次使用後，通常是2~7次，需要對填料進行再生，純化同一種蛋白可更多次，試具體(ti) 情況而定。可以選擇0.5~1柱體(ti) 積200mM EDTA+500 mM NaCl （pH=7）的緩衝(chong) 液將金屬離子剝離。金屬離子的重新螯合參照4.3小節。

4.8  在位清洗（CIP）

通常上述的再生過程可將填料徹-底清洗。若發生柱壓升高，或為(wei) 了避免交叉汙染，將金屬離子剝離後可進行在位清洗過程。可采用以下溶劑進行在位清洗：2mol/L NaCl ，1mol/L NaOH、70%乙醇或 30%異丙醇等。在位清洗可有效去除介質上的雜質，反向效果更佳。清洗後需用3~5 柱體(ti) 積的純水除去上述溶劑。

4.9 填料保存

填料的初始保存液為(wei) 20%乙醇，使用過後可繼續用20%乙醇保存。保存溫度在2~30 ℃為(wei) 宜，不可凍存。