肝素-瓊脂糖

肝素-瓊脂糖

1 、產(chan) 品介紹

Heparin NUPharose FF和Heparin NUPharose HP是肝素親(qin) 和填料，FF為(wei) Fast Flow的縮寫(xie) ，具備快流速的特點，可用於(yu) 快速純化蛋白質，適用性廣，易於(yu) 放大。HP為(wei) High Performance的縮寫(xie) ，具備分辨率高的特點。肝素親(qin) 和的原理較為(wei) 複雜，一般認為(wei) 肝素與(yu) 蛋白的結合 是離子相互作用、氫鍵與(yu) 範德華力等多種驅動力共同作用的結果。肝素填料主要用於(yu) 凝-血酶III、凝血-因子、脂蛋白、酯酶、激素、幹擾素等的分離純化。也有文獻報道將肝素填料用於(yu) 外泌體(ti) 的純化。

2 、產(chan) 品特點與(yu) 技術指標

注：a90%體(ti) 積以上的微球在此粒徑範圍；bDBC10%測試條件為(wei) ：10%流穿，重組 人酸性成纖維細胞生長因子（rh-aFGF），6 min 停留時間；c 10 cm 柱高下的最大測試流 速。

3 、使用方法參考

3.1  色譜柱裝填

以下闡述與(yu) 層析係統連接時，填料的色譜柱裝填方法。

（1）所有需要用到的材料的溫度要與(yu) 色譜操作的溫度一樣，液體(ti) 最好做脫氣處理。

（2）填料用量計算：通過沉降定量填料體(ti) 積，需要的沉降填料體(ti) 積=柱體(ti) 積×壓縮比（也稱壓縮因子）。沉降體(ti) 積是指填料在 20%乙醇保存液中自然沉降完-全讀取的穩定體(ti) 積。Heparin NUPharoseFF的壓縮比為(wei) ~1.15，Heparin NUPharose HP的壓縮比為(wei) ~1.20。為(wei) 使達到裝柱比，可通過柱頭下壓的方法，也可以通過高流速壓柱。

（3）填料清洗：將填料懸液充分搖勻後量取相應體(ti) 積，抽濾除去液體(ti) ，並用約3倍填料體(ti) 積的純化水洗滌，重複3次，以除去保存液。

（4）裝柱填料懸液準備：將填料轉移到適當的容器中，加入適量的裝柱液，製成 50~75 v%的裝柱填料懸液，使用前攪勻。

（5）裝填前準備：在清洗幹淨的層析柱下端加入裝柱液，以除去下墊片及層析柱下端的空氣，在柱內(nei) 保留少量的蒸餾水，擰緊下堵頭，調整柱子使其垂直於(yu) 地麵。

（6）裝填：將攪勻後的填料懸液一次性緩慢倒入層析柱內(nei) （必要時使用裝柱器），為(wei) 避免引入氣泡，應使之沿層析柱內(nei) 壁自然流下。將所有填料加入後， 用裝柱液將裝柱器加滿，擰緊裝柱器上蓋，將柱子與(yu) 層析係統連接。

（7）壓柱：使柱內(nei) 填料自然沉降（或50~150 cm/h的低流速下沉降），待填料沉降完-全後（填料與(yu) 液體(ti) 的界麵清晰），去除裝柱器，裝上上柱頭，並將柱頭下降至界麵處；通過高流速（推薦流速見下表，注意柱壓不超過0.3MPa），繼續壓柱至界麵清晰穩定，標記界麵穩定時的柱高。停泵，打開柱頭上的閥門/堵頭，關(guan) 閉柱底的閥門/堵頭，下壓柱頭至標記位置下方與(yu) 壓縮比對應的位置，旋緊柱頭，裝柱完成。裝柱完成後，需用高流速平衡柱內(nei) 的填料。

3.2  柱效測定和評價(jia)

完成裝柱後、使用前可通過柱效測定和評價(jia) 可以確認層析柱裝填質量。柱效通常用理論塔板高度（HETP）和非對稱因子（As）來評價(jia) 。

3.3  平衡與(yu) 上樣（Equilibration & Loading）

在上樣前，可用初始緩衝(chong) 液A在操作流速下平衡層析柱，觀察檢測器的變化，直到電導、pH等參數不變。本產(chan) 品的緩衝(chong) 液體(ti) 係可為(wei) 磷酸鹽、檸檬酸鹽和Tris-HCl等，濃度為(wei) 10~20 mM ，pH為(wei) 7~8為(wei) 宜。

樣品通常溶於(yu) 上述緩衝(chong) 液A，或者將樣品溶液進行換液處理，置換成緩衝(chong) 液A體(ti) 係。上樣量可按“mg 目標蛋白/mL填料"來設定，通常為(wei) DBC10%的50~80%，例如Heparin NUPharoseFF產(chan) 品對rh-aFGF的DBC10%為(wei) ~10mg/mL，純化時的上樣量可為(wei) 5~8mg/mL。除了DBC10%，也可以測試上樣流穿液中的目標蛋白確定上樣量。

3.4  洗雜（wash）

在緩衝(chong) 液A中添加一定量的鹽對上樣後的色譜柱進行衝(chong) 洗可以抑製非特異性吸附，從(cong) 而提高產(chan) 物純度。200~600mM的NaCl是常用的提高離子強度的鹽，具體(ti) 的離子強度可以通過線性梯度或者階躍梯度確定。洗雜的體(ti) 積通常為(wei) 3~10個(ge) 柱體(ti) 積。

3.5  洗脫（Elution）

洗脫過程則可以進一步提高緩衝(chong) 液A中的鹽濃度，添加1.5~2 M的NaCl可將目的蛋白有效洗脫。

3.6  再生與(yu) 在位清洗（CIP）

通常可用5 CV的洗脫液將填料再生。若有失活蛋白質或脂類物質在再生時洗不掉,可用在位清洗（CIP）除去。可采用以下選擇進行在位清洗：0.1mol/L NaOH、非離子型表麵活性劑等。在位清洗可有效去除介質上的雜質，反向效果更佳。具體(ti) 的CIP溶液選擇可參考下表。

3.7  填料保存

填料的初始保存液為(wei) 20%乙醇，含50mM醋酸鈉，使用過後可繼續用相同的保存液。保存溫度在2~30 ℃為(wei) 宜，不可凍存。