藍膠-瓊脂糖

藍膠-瓊脂糖

1 、產(chan) 品介紹

Blue NUPharoseFF 是一種染料親(qin) 和填料，通常稱為(wei) 藍膠，Blue NUPharose FF的配基為(wei) 三嗪類活性染料，特殊的結構決(jue) 定了其與(yu) 蛋白結合的複雜性，一般認為(wei) 其通過靜電相互作用、疏水相互作用以及氫鍵等作用力與(yu) 蛋白結合，適用於(yu) 脫氫酶、激酶、血漿類蛋白等的分離純化。

2 、產(chan) 品特點與(yu) 技術指標

注：a90%體(ti) 積以上的微球在此粒徑範圍；bDBC10%測試條件為(wei) ：10%流穿，4 min 停留時間；c 10 cm 柱高下的最大測試流速。

3 、染料親(qin) 和層析原理

 Blue NUPharose FF 配基的特殊結構決(jue) 定了其對蛋白質的吸附是一個(ge) 複雜的過程。除對蛋白質分子上的二核苷酸鏈具有親(qin) 和作用外，其蒽醌雜環與(yu) 蛋白質分子非極性麵之間存在疏水作用，芳香環上的磺酸基又使其具有離子交換基團的性質，可能導致蛋白與(yu) 配基之間存在非均一結合。

因此對於(yu) 不同的蛋白及配基和蛋白之間的結合情況也不盡相同。以BSA為(wei) 例，pH值的變化對其在Blue NUPharose FF上的吸附影響非常顯著。隨著pH值的升高，吸附容量急劇下降。主要原因是隨著pH值的升高，蛋白質分子上帶有正電荷的區域將減小，導致與(yu) 染料之間的靜電相互作用減弱，所以吸附量降低。當pH值在5.5~8.0降低時，蛋白質吸附容量的提高主要是由蛋白質分子中組-氨酸殘基引起的。而BSA分子中具有較高水平的組-氨酸殘基含量(17個(ge) 組-氨酸殘基/581殘基)，所以吸附量隨PH值的變化比較顯著。

4 、使用方法參考

4.1 色譜柱裝填

以下闡述與(yu) 層析係統連接時，填料的色譜柱裝填方法。

（1）所有需要用到的材料的溫度要與(yu) 色譜操作的溫度一樣，液體(ti) 最好做脫氣處理。

（2）填料用量計算：通過沉降定量填料體(ti) 積，需要的沉降填料體(ti) 積=柱體(ti) 積×壓縮比（也稱壓縮因子）。沉降體(ti) 積是指填料在 20%乙醇保存液中自然沉降完-全讀取的穩定 體(ti) 積。Blue NUPharoseFF的壓縮比為(wei)  1.15。為(wei) 使達到裝柱比，可通過柱頭下壓的方法，也可以通過高流速壓柱。

（3）填料清洗：將填料懸液充分搖勻後量取相應體(ti) 積，抽濾除去液體(ti) ，並用約3倍填料體(ti) 積的純化水洗滌，重複3次，以除去保存液。

（4）裝柱填料懸液準備：將填料轉移到適當的容器中，加入適量的裝柱液，製成50~75 v%的裝柱填料懸液，使用前攪勻。

（5）裝填前準備：在清洗幹淨的層析柱下端加入裝柱液，以除去下墊片及層析柱下端的空氣，在柱內(nei) 保留少量的裝柱液，擰緊下堵頭，調整柱子使其垂直於(yu) 地麵。

（6）裝填：將攪勻後的填料懸液一次性緩慢倒入層析柱內(nei) （必要時使用裝柱器），為(wei) 避免引入氣泡，應使之沿層析柱內(nei) 壁自然流下。將所有填料加入後，用裝柱液將裝柱器加滿，擰緊裝柱器上蓋，將柱子與(yu) 層析係統連接。

（7）壓柱：使柱內(nei) 填料自然沉降（或50~150 cm/h的低流速下沉降），待填料沉降完-全後（填料與(yu) 液體(ti) 的界麵清晰），去除裝柱器，裝上上柱頭，並將柱頭下降至界麵處；通過高流速（推薦流速見下表，注意柱壓不超過0.3MPa），繼續壓柱至界麵清晰穩定，標記界麵穩定時的柱高。停泵，打開柱頭上的閥門/堵頭，關(guan) 閉柱底的閥門/堵頭，下壓柱頭至標記位置下方與(yu) 壓縮比對應的位置，旋緊柱頭，裝柱完成。裝柱完成後，需用高流速平衡柱內(nei) 的填料。

4.2  柱效測定和評價(jia)

完成裝柱後、使用前可通過柱效測定和評價(jia) 可以確認層析柱裝填質量。柱效通常用理論塔板高度（HETP）和非對稱因子（As）來評價(jia) .

4.3  平衡與(yu) 上樣（Equilibration & Loading）

結合緩衝(chong) 液常見的磷酸鹽、醋酸鹽等均可作為(wei) 結合緩衝(chong) 液，需根據樣品特點選擇合適的結合緩衝(chong) 液（記為(wei) 緩衝(chong) 液A）。根據第3章節的染料親(qin) 和層析原理，適當低的pH的結合緩衝(chong) 液能促進蛋白的結合，一般情況下pH範圍在5.5~8.0之間宜。

實際使用過程中，上樣料液的體(ti) 積往往較大，在上樣前，需用緩衝(chong) 液A在操作流速下平衡層析柱，該過程通常需要5~10個(ge) 柱體(ti) 積的緩衝(chong) 液A，以電導、pH 等檢測信號參數不變且與(yu) 緩衝(chong) 液A對應為(wei) 準。

上樣量可按“mg 目標蛋白/mL填料"來設定，通常為(wei) DBC10%的50~80%，例如 Blue NUPharose FF產(chan) 品對BSA的DBC10%為(wei) ~20mg/mL，純化時上樣量可為(wei) 10~16mg/mL。 除了DBC10%，也可以測試上樣流穿液中的目標蛋白確定上樣量。上樣前需要對樣品進行離心（10000 g以上）、過濾（0.22或0.45 μm）處理，以免堵塞色譜柱，樣品的pH需與(yu) 上樣緩衝(chong) 液保持一致。

上樣後需要3~10個(ge) 柱體(ti) 積的緩衝(chong) 液 A 再平衡層析柱。

4.4  洗脫（Regeneration）

染料親(qin) 和的樣品多種多樣，親(qin) 和原理較為(wei) 複雜，相應的洗脫方式也需隨樣品不同而改變。通常可以改變緩衝(chong) 液的pH、離子強度（例如添加2 M NaCl）和極性（例如添加50%乙二醇）。純化酶時可加入低濃度的輔因子進行競爭(zheng) 洗脫。

4.5  再生（Regeneration）

可以采用高pH（0.1MTris，0.5 M NaCl，pH 8.5）和低pH（0.1MNaAc，0.5M NaCl，pH 4.5）交替清洗4~5次去除結合較強的蛋白質使層析柱再生。

4.6  在位清洗（CIP）

通常上述的再生過程可將填料徹-底清洗。若發生柱壓升高，或為(wei) 了避免交叉汙染，將金屬離子剝離後可進行在位清洗過程。可采用以下溶劑進行在位清洗：2mol/L NaCl，1mol/L NaOH、70%乙醇或30%異丙醇等。在位清洗可有效去除介質上的雜質，反向效果更佳。清洗後需用3~5 柱體(ti) 積的純水除去上述溶劑。

4.7 填料保存

填料的初始保存液為(wei) 20%乙醇，0.1mol/L KH2PO4，pH 8.0。使用過後可繼續相同的溶液保存。保存溫度在2~8 ℃為(wei) 宜，不可凍存。