鏈黴親和素的突變體-瓊脂糖凝膠

鏈黴親(qin) 和素的突變體(ti) -瓊脂糖凝膠

1 、產(chan) 品介紹

Strep-Tactin 2 NUPharose FF是鏈黴親(qin) 和素的突變體(ti) （Strep-Tactin2配基）和瓊脂糖凝膠偶聯形成的和層析分離介質，用於(yu) 分離、純化StrepII或Twin Strep標簽蛋白。Strep II標簽為(wei) 8個(ge) 氨基酸的小標簽（WSHPQFEK），一般不影響融合後蛋白質的結構和功能，常用於(yu) 融合表達蛋白質的檢測和純化。Twin Strep標簽為(wei) 兩(liang) 個(ge) StrepII串聯的標簽，相比Strep II標簽，Twin Strep標簽與(yu) Strep-Tactin 2配基的親(qin) 和力更高。

本產(chan) 品的Strep-Tactin 2配基與(yu) 上一代Strep-Tactin 配基相比，對Strep II標簽的親(qin) 和力進一步提高，與(yu) 生物-素的親(qin) 和力大幅削弱。因而本產(chan) 品能夠更牢固的結合Strep II融合蛋白，在融合蛋白表達豐(feng) 度較低時，相對捕獲量更高，載量和得率更高。在洗脫方麵，可以使用生物-素進行洗脫，比采用昂貴的脫硫生物-素洗脫更經濟，且使用後可采用10~50 mM NaOH進行再生。本產(chan) 品對Strep II標簽具有高度特異性，一般隻需一步純化就能獲得高純度的蛋白質樣品。

2 、產(chan) 品特點與(yu) 技術指標 

注：a90%體(ti) 積以上的微球在此粒徑範圍；bDBC10%測試條件為(wei) ：10%流穿，大腸杆菌表達的帶Strap II 標簽的增強型綠色熒光蛋白，6 min 停留時間。

 3 、Strep II 、Twin Strep 標簽親(qin) 和層析

Strep-Tactin 2 NUPharose FF對Strep II、Twin Strep標簽蛋白的特異性結合以及純化過程如圖1和圖2所示。

4 、使用方法參考

4.1  色譜柱裝填

以下闡述與(yu) 層析係統連接時，填料的色譜柱裝填方法。

（1）所有需要用到的材料的溫度要與(yu) 色譜操作的溫度一樣，液體(ti) 最好做脫氣處理。

（2）填料用量計算：通過沉降定量填料體(ti) 積，需要的沉降填料體(ti) 積=柱體(ti) 積×壓縮比（也稱壓縮因子）。沉降體(ti) 積是指填料在20%乙醇保存液中自然沉降完-全讀取的穩定體(ti) 積。Strep-Tactin 2 NUPharose FF的壓縮比為(wei) 1.15 。為(wei) 使達到裝柱比，可通過柱頭下壓的方法，也可以通過高流速壓柱。

（3）填料清洗：將填料懸液充分搖勻後量取相應體(ti) 積，抽濾除去液體(ti) ，並用約3倍填料體(ti) 積的純化水洗滌，重複3次，以除去保存液。

（4）裝柱填料懸液準備：將填料轉移到適當的容器中，加入適量的裝柱液，製成50~75 v%的裝柱填料懸液，使用前攪勻。

（5）裝填前準備：在清洗幹淨的層析柱下端加入裝柱液，以除去下墊片及層析柱下端的空氣，在柱內(nei) 保留少量的蒸餾水，擰緊下堵頭，調整柱子使其垂直於(yu) 地麵。

（6）裝填：將攪勻後的填料懸液一次性緩慢倒入層析柱內(nei) （必要時使用裝柱器），為(wei) 避免引入氣泡，應使之沿層析柱內(nei) 壁自然流下。將所有填料加入後，用裝柱液將裝 柱器加滿，擰緊裝柱器上蓋，將柱子與(yu) 層析係統連接。

（7）壓柱：使柱內(nei) 填料自然沉降（或50~150 cm/h的低流速下沉降），待填料沉降完-全後（填料與(yu) 液體(ti) 的界麵清晰），去除裝柱器，裝上上柱頭，並將柱頭下降至界麵處；通過高流速（推薦流速見下表，注意柱壓不超過0.3 MPa），繼續壓柱至界麵清晰 穩定，標記界麵穩定時的柱高。停泵，打開柱頭上的閥門/堵頭，關(guan) 閉柱底的閥門/堵 頭，下壓柱頭至標記位置下方與(yu) 壓縮比對應的位置，旋緊柱頭，裝柱完成。裝柱完成後，需用高流速平衡柱內(nei) 的填料。

4.2  柱效測定和評價(jia)

完成裝柱後、使用前可通過柱效測定和評價(jia) 可以確認層析柱裝填質量。柱效通常用理論塔板高度（HETP）和非對稱因子（As）來評價(jia) 。

4.3  平衡與(yu) 上樣（Equilibration & Loading）

Strep-Tactin 2 NUPharose FF填料的工作pH範圍為(wei) 6~10，推薦下述緩衝(chong) 液A為(wei) 平衡與(yu) 上樣緩衝(chong) 液。樣品需作澄清處理，並用緩衝(chong) 液A稀釋或者換液成緩衝(chong) 液A。

緩衝(chong) 液A：100mM Tris-HCl，150mM NaCl，1mM EDTA，pH8.0。平衡5個(ge) 柱體(ti) 積，建議流速為(wei) ～150 cm/h上樣流速為(wei) 50~150cm/h，較小的流速有利於(yu) 載量的提高，可根據實際結合情況選擇流速，能獲得較好的效果。

4.4 再平衡

上樣後用緩衝(chong) 液A再平衡5~10 CV，或平衡至基線，洗去雜質，推薦流速為(wei) ~150cm/h。

4.5 洗脫（Elution）

推薦含10~50 mM的D-生物-素作為(wei) 洗脫緩衝(chong) 液，如下述的緩衝(chong) 液B。

緩衝(chong) 液B：50mM d-Biotin，100 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，1 mM EDTA，pH8.0。 用洗脫緩衝(chong) 液洗6-10 CV，建議流速為(wei) ～150 cm/h。

4.6 再生（Regeneration）

在一次或多次使用後，需要對填料進行再生：水，3~5 CV，～150cm/h；10~50 mM NaOH，3 CV，3 min接觸時間；水，3~5 CV，～150 cm/h；再用緩衝(chong) 液A平衡5~ 10 CV，150 cm/h。

4.7 填料保存

填料的初始保存液為(wei) 20%乙醇，使用過後可繼續用20%乙醇保存。保存溫度在2~8 ℃為(wei) 宜，不可凍存