普施安紅-瓊脂糖

普施安紅-瓊脂糖

1 、產(chan) 品介紹

Red NUPharoseFF是活性紅120（又稱普施安紅HE-3B）活性染料鍵合在NUPharose瓊脂糖微球上得到的親(qin) 和填料。活性紅120是多環染料，與(yu) NADP+具有結構類似性，可用於(yu) 純化核苷酸依賴性酶、脂蛋白、乳酸脫氫酶、纖溶酶原、肽、激素等的純化。除了作為(wei) 親(qin) 和填料使用，本產(chan) 品配基含芳香環和陰離子，也通過靜電作用或者疏水相互作用進行非親(qin) 和純化。

2 、產(chan) 品特點與(yu) 技術指標

注：a90%體(ti) 積以上的微球在此粒徑範圍；bDBC10%測試條件為(wei) ：10%流穿，；c 10 cm 柱高下的最 大測試流速。

3 、使用方法參考

 3.1 色譜柱裝填

以下闡述與(yu) 層析係統連接時，填料的色譜柱裝填方法。

（1）所有需要用到的材料的溫度要與(yu) 色譜操作的溫度一樣，液體(ti) 最好做脫氣處理。

（2）填料用量計算：通過沉降定量填料體(ti) 積，需要的沉降填料體(ti) 積=柱體(ti) 積×壓縮比（也稱壓縮因子）。沉降體(ti) 積是指填料在20%乙醇保存液中自然沉降完-全讀取的穩定體(ti) 積。Red NUPharose FF的壓縮比為(wei) 1.15。為(wei) 使達到裝柱比，可通過柱頭下壓的方法，也可以通過高流速壓柱。

（3）填料清洗：將填料懸液充分搖勻後量取相應體(ti) 積，抽濾除去液體(ti) ，並用約3倍填料體(ti) 積的純化水洗滌，重複3次，以除去保存液。

（4）裝柱填料懸液準備：將填料轉移到適當的容器中，加入適量的裝柱液，製成 50~75 v%的裝柱填料懸液，使用前攪勻。

（5）裝填前準備：在清洗幹淨的層析柱下端加入裝柱液，以除去下墊片及層析柱下端的空氣，在柱內(nei) 保留少量的裝柱液，擰緊下堵頭，調整柱子使其垂直於(yu) 地麵。

（6）裝填：將攪勻後的填料懸液一次性緩慢倒入層析柱內(nei) （必要時使用裝柱器），為(wei) 避免引入氣泡，應使之沿層析柱內(nei) 壁自然流下。將所有填料加入後，用裝柱液將裝柱器加滿，擰緊裝柱器上蓋，將柱子與(yu) 層析係統連接。

（7）壓柱：使柱內(nei) 填料自然沉降（或 50~150 cm/h 的低流速下沉降），待填料沉降完-全後（填料與(yu) 液體(ti) 的界麵清晰），去除裝柱器，裝上上柱頭，並將柱頭下降至界麵處；通過高流速（推薦流速見下表，注意柱壓不超過0.3MPa），繼續壓柱至界麵清晰穩定，標記界麵穩定時的柱高。停泵，打開柱頭上的閥門/堵頭，關(guan) 閉柱底的閥門/堵頭，下壓柱頭至標記位置下方與(yu) 壓縮比對應的位置，旋緊柱頭，裝柱完成。裝柱完成後，需用高流速平衡柱內(nei) 的填料。

3.2  柱效測定和評價(jia)

完成裝柱後、使用前可通過柱效測定和評價(jia) 可以確認層析柱裝填質量。柱效通常用理論塔板高度（HETP）和非對稱因子（As）來評價(jia) 。

3.3  平衡與(yu) 上樣（Equilibration & Loading）

在上樣前，需用緩衝(chong) 液A在操作流速下平衡層析柱，該過程通常需要5~10個(ge) 柱體(ti) 積的緩衝(chong) 液A，以電導、pH等檢測信號參數不變且與(yu) 緩衝(chong) 液A對應為(wei) 準。可以選擇磷 酸鹽、Tris-HCl等常見的緩衝(chong) 體(ti) 係。

上樣量可按“mg目標蛋白/mL填料"來設定，通常為(wei) DBC10%的50~80%，例如Red NUPharoseFF產(chan) 品對的動態結合載量為(wei) ~15mg/mL，純化時的上樣量可為(wei) 7.5~12mg/mL。除了DBC10%，也可以測試上樣流穿液中的目標蛋白確定上樣量。上樣前需要對樣品進行離心（10000 g以上）、過濾（0.22或0.45μm）處理，以免堵塞色譜柱。

上樣後需要3~10個(ge) 柱體(ti) 積的緩衝(chong) 液A 再平衡層析柱。

3.5 洗脫（Elution）

通常在緩衝(chong) 液A中添加3 M NaCl或者2 M KCl可將目標蛋白洗脫。

3.6  再生（Regeneration）

純化後可用弱酸和弱堿性緩衝(chong) 液交替衝(chong) 洗色譜柱3~4 次，進行填料再生，例如0.1mol/L NaAc+0.5mol/L NaCl（pH4.5）和0.1mol/L Tris·HCl+0.5mol/L NaCl（pH8.5）。然後用平衡緩衝(chong) 溶液平衡。

3.7 在位清洗（CIP）

通常上述的洗脫和再生過程可將填料徹-底清洗。若發生柱壓升高，或為(wei) 了避免交叉汙染，可采用以下溶劑進行在位清洗：0.1~0.5 mol/L NaOH、70%乙醇或30%異丙醇等。在位清洗可有效去除介質上的雜質，反向效果更佳。清洗後需用3~5 柱體(ti) 積的純水除去上述溶劑。

3.8  填料保存

填料的初始保存液為(wei) 20%乙醇，使用過後可繼續用20%乙醇並添加0.5M NaCl保存。保存溫度在2~30 ℃為(wei) 宜，不可凍存。