易洗脫鏈黴親和素-瓊脂糖

易洗脫鏈黴親(qin) 和素-瓊脂糖

1 、產(chan) 品介紹

ee-SANUPharoseFF是將基因工程改造的鏈黴親(qin) 和素（Streptavidin ，SA）和瓊脂糖凝膠偶聯而成的親(qin) 和層析分離介質。ee意為(wei) 易洗脫（easy elution），即可以溫和洗脫結合在介質上的生-物素化物質，如生-物素化抗原、生-物素化抗體(ti) 、生-物素化蛋白、生-物素化核酸等，可用於(yu) Avi-Tag融合表達的生-物素化蛋白的純化、經過標記反應後的生-物素化和非生-物素化物質的分離、生-物素化抗原抗體(ti) 固定化和重複回收利用等。

Streptavidin NUPharoseFF，由於(yu) 鏈黴親(qin) 和素與(yu) 生-物素的超-強親(qin) 和力，溫和常用的方法不能將生-物素標記物質洗脫。ee-SA配基經過分子層麵的設計改造，大幅降低了與(yu) 生-物素的親(qin) 和力，同時保持了與(yu) 生-物素的特異性。結合在ee-SANUPharose FF填料上的生-物素化物質可通過含D-生-物素的緩衝(chong) 液競爭(zheng) 洗脫，該洗脫方式溫和，一般不會(hui) 影響目標物的活性，洗脫液中的D-生-物素可通過換液方式去除。因而通過ee-SANUPharoseFF的一步層析就可獲得有活性、高純度的生-物素化物質。

2 、產(chan) 品特點與(yu) 技術指標

注：a90%體(ti) 積以上的微球在此粒徑範圍；bDBC10%測試條件為(wei) ：D-生-物素標記 BSA ，10%流穿，6 min 停留時間；c 10 cm 柱高下的最大測試流速。

3 、易洗脫鏈黴親(qin) 和素填料應用原理簡介

鏈黴親(qin) 和素與(yu) D-生-物素之間的親(qin) 和力非常高，其解離常數在10−14 mol/L 數量級，是自然界最-強的非共價(jia) 相互作用之一。因而常規的Streptavidin NUPharose FF填料與(yu) 生-物素標記物質結合後，需要在變性條件下洗脫。在該使用方式下，樣品易失活，填料的性能也受影響。

ee-SANUPharoseFF填料上的ee-SA配基經過基因工程改造後，保持了與(yu) 生-物素的 特異性的同時，削弱了親(qin) 和力，因而可通過 D-生-物素競爭(zheng) 洗脫（圖 1），擴展了鏈黴親(qin)  和素填料的應用範圍。圖 2 為(wei)  ee-SANUPharoseFF 純化生-物素化物質的過程，包含特異 性結合、D-生-物素競爭(zheng) 洗脫、NaOH 再生等環節。

4 、使用方法參考

 4.1 色譜柱裝填

以下闡述與(yu) 層析係統連接時，填料的色譜柱裝填方法。

（1）所有需要用到的材料的溫度要與(yu) 色譜操作的溫度一樣，液體(ti) 最好做脫氣處理。

填料用量計算：通過沉降定量填料體(ti) 積，需要的沉降填料體(ti) 積=柱體(ti) 積×壓縮比（也稱壓縮因子）。沉降體(ti) 積是指填料在20%乙醇保存液中自然沉降完-全讀取的穩定 體(ti) 積。ee-SANUPharoseFF的壓縮比為(wei) 1.15。為(wei) 使達到裝柱比，可通過柱頭下壓的方法，也可以通過高流速壓柱。

填料清洗：將填料懸液充分搖勻後量取相應體(ti) 積，抽濾除去液體(ti) ，並用約3倍填料體(ti) 積的純化水洗滌，重複3次，以除去保存液。

（4）裝柱填料懸液準備：將填料轉移到適當的容器中，加入適量的裝柱液，製成50~75 v%的裝柱填料懸液，使用前攪勻。

（5）裝填前準備：在清洗幹淨的層析柱下端加入裝柱液，以除去下墊片及層析柱下端的空氣，在柱內(nei) 保留少量的蒸餾水，擰緊下堵頭，調整柱子使其垂直於(yu) 地麵。

（6）裝填：將攪勻後的填料懸液一次性緩慢倒入層析柱內(nei) （必要時使用裝柱器），為(wei) 避免引入氣泡，應使之沿層析柱內(nei) 壁自然流下。將所有填料加入後，用裝柱液將裝柱器加滿，擰緊裝柱器上蓋，將柱子與(yu) 層析係統連接。

（7）壓柱：使柱內(nei) 填料自然沉降（或50~150 cm/h的低流速下沉降），待填料沉降完-全後（填料與(yu) 液體(ti) 的界麵清晰），去除裝柱器，裝上上柱頭，並將柱頭下降至界麵處；通過高流速（推薦流速見下表，注意柱壓不超過0.3MPa），繼續壓柱至界麵清晰穩定，標記界麵穩定時的柱高。停泵，打開柱頭上的閥門/堵頭，關(guan) 閉柱底的閥門/堵頭，下壓柱頭至標記位置下方與(yu) 壓縮比對應的位置，旋緊柱頭，裝柱完成。裝柱完成後，需用高流速平衡柱內(nei) 的填料。

4.2  柱效測定和評價(jia)

完成裝柱後、使用前可通過柱效測定和評價(jia) 可以確認層析柱裝填質量。柱效通常用 理論塔板高度（HETP）和非對稱因子（As）來評價(jia) 。

4.3  平衡與(yu) 上樣

（1）緩衝(chong) 液選擇：一般選用pH6~8的結合緩衝(chong) 液，常用緩衝(chong) 液有10~100mM磷 酸鈉緩衝(chong) 液、20~200mM Tris-HCl緩衝(chong) 液等，根據樣品的穩定性，也可添加其他成分，如NaCl、還原劑、螯合劑等。若不確定最合適的緩衝(chong) 體(ti) 係，在初次使用ee-SANUPharose FF時，推薦使用20mM PBS（20 mM NaH2PO4，0.15 M NaCl，調節pH 7.4）或20 mM Tris-HCl，0.15M NaCl，pH8.0作為(wei) 結合緩衝(chong) 液。

（2）樣品處理：樣品的緩衝(chong) 液應與(yu) 所選結合緩衝(chong) 液一致。為(wei) 保證緩衝(chong) 液一致，可以在結合緩衝(chong) 液中破碎細菌、或調解pH 與(yu) 結合緩衝(chong) 液一致、或交換至結合緩衝(chong) 液（常用方法有透析、超濾、脫鹽柱換液等）、或用結合緩衝(chong) 液稀釋2~10倍等。樣品上柱前應0.45μm過濾。

（3）平衡：用結合緩衝(chong) 液平衡5個(ge) 柱體(ti) 積，建議流速為(wei) ~150 cm/h

（4）上樣流速：推薦線性流速20~100 cm/h。較小的流速有利於(yu) 載量的提高，可根據實際結合情況選擇流速，能獲得較好的效果。

（5）再平衡：上樣後用結合緩衝(chong) 液再平衡5~10個(ge) 柱體(ti) 積，或平衡至基線，洗去雜質，推薦流速為(wei) ~150 cm/h。

4.3 洗脫

結合了生-物素化物質的ee-SANUPharoseFF可采用溫和的方式洗脫，一般在結合緩衝(chong) 液中加入1-10 mM的D-生-物素作為(wei) 洗脫緩衝(chong) 液，通過競爭(zheng) 的方法洗脫。

4.4 再生

（1）填料使用後需要再生，本產(chan) 品耐受一定的堿性，推薦使用2~5個(ge) 柱體(ti) 積的 20-100 mM NaOH 溶液反向清洗柱子，進行再生，推薦流速為(wei) ~150 cm/h。

（2）其他方法，比如 1-2M NaCl 、70%乙醇、30%異丙醇等，也可用於(yu) 該介質的再生。

4.5 填料保存

填料的初始保存液為(wei) 20%乙醇，使用過後可繼續用20%乙醇保存。保存溫度在2~8℃為(wei) 宜，不可凍存。