TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒樣品應該如何準備

TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒樣品應該如何準備

樣品準備

A. 石蠟包埋組織切片

1）室溫下將石蠟組織切片放入二甲苯中浸泡5min，重複一次，以*脫掉石蠟。

2）室溫下用100%乙醇浸泡切片5min，重複一次。

3）室溫下用梯度乙醇（90、80、70%）各浸洗1次，每次3min。

4）用PBS輕輕潤洗切片，並用濾紙小心吸幹玻片上樣本周圍多餘(yu) 的液體(ti) 。這時，可用石蠟筆或疏水筆在樣品周圍描繪樣品分布的輪廓，便於(yu) 下遊透性處理和平衡標記操作。在實驗過程中，切勿讓樣品幹燥，處理好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤。

5） 配製Proteinase K工作液：按1:100的比例，用PBS作為(wei) 稀釋液來稀釋2mg/ml的Proteinase K溶液，使其終濃度為(wei) 20μg/ml。

6）每個(ge) 樣本上滴加100μl上述Proteinase K工作液，使其被全部覆蓋，室溫孵育20min。

【注】：Proteinase K幫助組織和細胞對後續步驟的染色試劑通透。孵育時間過長會(hui) 增加組織切片在後續洗滌步驟中從(cong) 載波片上脫落的風險，過短則可能造成透性處理不充分，影響標記效率。未得到更好的結果，可能需要優(you) 化Proteinase K孵育的時間。

7）用PBS溶液潤洗樣本，輕輕去掉多餘(yu) 液體(ti) ，並用濾紙小心吸幹載玻片上樣本周圍的液體(ti) 。處理後的樣本放在濕盒中保存樣本的濕潤。

B. 組織冰凍切片

1）將玻片浸沒在4%多聚甲醛溶液（溶於(yu) PBS）中固定，室溫下孵育15min。

2）輕輕去掉多餘(yu) 液體(ti) ，並用濾紙小心吸幹玻片上樣本周圍多餘(yu) 的液體(ti) 。

3）將玻片浸沒在PBS溶液中，室溫孵育15min。

4）輕輕去掉多餘(yu) 液體(ti) ，並用濾紙小心吸幹玻片上樣本周圍多餘(yu) 的液體(ti) 。這時，可用石蠟筆或疏水筆在樣品周圍描繪樣品分布的輪廓，便於(yu) 下遊透性處理和平衡標記操作。在實驗過程中，切勿讓樣品幹燥，處理好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤。

5） 配製Proteinase K工作液：按1:100的比例，用PBS作為(wei) 稀釋液來稀釋2mg/ml的Proteinase K溶液，使其終濃度為(wei) 20μg/ml。

6）每個(ge) 樣本上滴加100μl上述Proteinase K工作液，使其被全部覆蓋，室溫孵育10min。

【注】：Proteinase K幫助組織和細胞對後續步驟的染色試劑通透。孵育時間過長會(hui) 增加組織切片在後續洗滌步驟中從(cong) 載波片上脫落的風險，過短則可能造成透性處理不充分，影響標記效率。未得到更好的結果，可能需要優(you) 化Proteinase K孵育的時間。

7）用PBS溶液潤洗樣本2-3次。

8）輕輕去掉多餘(yu) 液體(ti) ，並用濾紙小心吸幹載玻片上樣本周圍的液體(ti) 。處理後的樣本放在濕盒中保存樣本的濕潤。

TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒樣品應該如何準備

C. 細胞爬片的準備

在Lab-Tek載玻片小室（Chamber Slides）上培養(yang) 貼壁細胞。在凋亡誘導處理之後，用PBS洗2遍載玻片。

D. 細胞塗片的製備

1）準備多聚賴氨酸包被的載玻片：吸取50–100 μl 0.01% (w/v)多聚賴氨酸水溶液，滴至每一片預清洗過的玻璃載玻片的表麵。在將要用於(yu) 固定細胞的區域將多聚賴氨酸溶液塗散為(wei) 一薄層。待載玻片晾幹之後，迅速用去離子水漂洗，然後讓包被後的載玻片在空氣中晾幹30-60 min。包被後的載玻片能在室溫儲(chu) 存數月。

2）以約2×10⁷個(ge) 細胞/ml的濃度將細胞重懸於(yu) PBS中，吸取50-100μl細胞懸液滴於(yu) 多聚賴氨酸包被的載玻片上，用一片幹淨的載玻片輕柔的塗開細胞懸液。

3）固定細胞，將載玻片浸入裝有4%新鮮配製於(yu) PBS中的多聚甲醛的染色缸中，在4℃放置25min。

4）洗滌載玻片，將其浸入PBS中，室溫放置5min。重複用PBS洗一次。

5）輕輕去掉多餘(yu) 液體(ti) ，並用濾紙小心吸幹玻片上樣本周圍多餘(yu) 的液體(ti) 。這時，可用石蠟筆或指甲油在樣品周圍描繪樣品分布的輪廓，便於(yu) 下遊透性處理和平衡標記操作。在實驗過程中，切勿讓樣品幹燥，處理好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤。

6） 配製Proteinase K工作液：按1:100的比例，用PBS作為(wei) 稀釋液來稀釋2mg/ml的Proteinase K溶液，使其終濃度為(wei) 20μg/ml。

7）每個(ge) 樣本上滴加100μl上述Proteinase K溶液，使其被全部覆蓋，室溫孵育5min（也可浸於(yu) 0.2%配製於(yu) PBS中的Triton X-100溶液中，室溫孵育5min進行通透處理）。

【注】：Proteinase K幫助組織和細胞對後續步驟的染色試劑通透。孵育時間過長會(hui) 增加組織切片在後續洗滌步驟中從(cong) 載波片上脫落的風險，過短則可能造成透性處理不充分，影響標記效率。未得到更好的結果，可能需要優(you) 化Proteinase K孵育的時間。

8）在盛有PBS溶液的敞口燒杯中浸沒清洗樣本2-3次。

9）輕輕去掉多餘(yu) 液體(ti) ，並用濾紙小心吸幹載玻片上樣本周圍的液體(ti) 。處理後的樣本放在濕盒中保存樣本的濕潤。

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