實時熒光定量PCR檢測服務-信帆生物

Nephrin 實時熒光定量PCR實驗檢測

上海信帆專(zhuan) 業(ye) 提供各類實驗室代測服務，包含PCR實驗代測，放免實驗代測，免疫組化實驗代測，免疫印跡實驗代測等，歡迎大家！

Nephrin 實時熒光定量PCR實驗檢測

所謂實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體(ti) 係中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個(ge) PCR進程，zui後通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。

一、 樣品RNA的抽提
 

1.  取凍存已裂解的細胞，室溫放置5分鍾使其*溶解。
 

2.  兩(liang) 相分離 每1 ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2 ml的lv仿，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體(ti) 15秒後，15到30℃孵育2到3分鍾。4℃下12 000 rpm離心15分鍾。離心後混合液體(ti) 將分為(wei) 下層的紅色酚lv仿相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配於(yu) 水相中。水相上層的體(ti) 積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。
 

3.  RNA沉澱 將水相上層轉移到一幹淨無RNA酶的離心管中。加等體(ti) 積異丙醇混合以沉澱其中的RNA，混勻後15到30℃孵育10分鍾後，於(yu) 4℃下12 000 rpm 離心10分鍾。此時離心前不可見的RNA沉澱將在管底部和側(ce) 壁上形成膠狀沉澱塊。
 

4.  RNA清洗 移去上清液，每1 mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1 ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配製），清洗RNA沉澱。混勻後，4℃下7 000 rpm離心5分鍾。
 

5.  RNA幹燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉澱在室溫空氣中幹燥5-10分鍾。
 

6.  溶解RNA沉澱 溶解RNA時，先加入無RNA酶的水40μl用槍反複吹打幾次，使其*溶解，獲得的RNA溶液保存於(yu) -80℃待用。
 

二、 RNA質量檢測
 

1.  紫外吸收法測定
 

先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調零。然後取少量RNA溶液用TE稀釋（1:100）後，讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，測定RNA溶液 濃度和純度。
 

 （1）濃度測定
 

A₂₆₀下讀值為(wei) 1表示40 μg RNA/ml。樣品RNA濃度(μg/ml)計算公式為(wei) ：A₂₆₀ ×稀釋倍數× 40 μg/ml。具體(ti) 計算如下：

RNA溶於(yu) 40 μl DEPC水中，取5 μl，1:100稀釋至495 μl的TE中，測得A₂₆₀ = 0.21

RNA 濃度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl

取5 ul用來測量以後，剩餘(yu) 樣品RNA為(wei) 35 μl，剩餘(yu) RNA總量為(wei) ：

35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg

（2）純度檢測
 

RNA溶液的A260/A280的比值即為(wei) RNA純度，比值範圍1.8到2.1。
 

2.  變性瓊脂糖凝膠電泳測定
 

（1）製膠
 

1 g瓊脂糖溶於(yu) 72 ml水中，冷卻至60℃，10 ml的10× MOPS電泳緩衝(chong) 液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。

10×MOPS電泳緩衝(chong) 液

濃度  成分

0.4 M  MOPS，pH 7.0

0.1 M  乙酸鈉

0.01 M  EDTA
 

灌製凝膠板，預留加樣孔至少可以加入25 μl溶液。膠凝後取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內(nei) ，加足量的1×MOPS電泳緩衝(chong) 液至覆蓋膠麵幾個(ge) 毫米。

（2）準備RNA樣品
 

取3 μgRNA，加3倍體(ti) 積的甲醛上樣染液，加EB於(yu) 甲醛上樣染液中至終濃度為(wei) 10 μg/ml。加熱至70℃孵育15分鍾使樣品變性。

（3）電泳
 

上樣前凝膠須預電泳5 min，隨後將樣品加入上樣孔。5-6 V/cm電壓下2 h，電泳至溴酚蘭(lan) 指示劑進膠至少2-3 cm。
 

（4）紫外透射光下觀察並拍照
 

28S和18S核糖體(ti) RNA的帶非常亮而濃（其大小決(jue) 定於(yu) 用於(yu) 抽提RNA的物種類型），上麵一條帶的密度大約是下麵一條帶的2倍。還有可能觀察到一個(ge) 更小稍微擴散的帶，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖體(ti) RNA）組成。在18S和28S核糖體(ti) 帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質，可能是由mRNA和其它異型RNA組成。RNA製備過程中如果出現DNA汙染，將會(hui) 在28S核糖體(ti) RNA帶的上麵出現，即更高分子量的彌散遷移物質或者帶，RNA的降解表現為(wei) 核糖體(ti) RNA帶的彌散。用數碼照相機拍下電泳結果。
 

三、樣品cDNA合成
 

1.  反應體(ti) 係
 

序號          反應物           劑量

1          逆轉錄buffer       2 μl

2         上遊引物              0.2 μl

3         下遊引物              0.2 μl

4          dNTP                   0.1 μl

5       逆轉錄酶MMLV     0.5 μl

6         DEPC水              5 μl

7          RNA模版            2 μl

8           總體(ti) 積               10 μl
 

輕彈管底將溶液混合，6 000 rpm短暫離心。
 

2.  混合液在加入逆轉錄酶MMLV 之前先70℃幹浴3分鍾，取出後立即冰水浴至管內(nei) 外溫度一致，然後加逆轉錄酶0.5 μl，37℃水浴60分鍾。
 

3.  取出後立即95℃幹浴3分鍾，得到逆轉錄終溶液即為(wei) cDNA溶液，保存於(yu) -80℃待用。
 

四、 梯度稀釋的標準品及待測樣品的管家基因（β-actin）實時定量PCR（內(nei) 參由我司上海信帆生物提供）
 

1.  β-actin陽性模板的標準梯度製備 陽性模板的濃度為(wei) 10¹¹，反應前取3 μl按10倍稀釋（加水27 μl並充分混勻）為(wei) 10¹⁰，依次稀釋至10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴，以備用。
 

2.  反應體(ti) 係如下：
 

標準品反應體(ti) 係
 

序號           反應物                           劑量

1       SYBR Green 1 染料             10 μl

2       陽性模板上遊引物F              0.5 μl

3      陽性模板下遊引物R              0.5 μl

4                 dNTP                            0.5 μl

5                 Taq酶                           1 μl

6           陽性模板DNA                    5 μl

7              ddH₂O                            32.5 μl

8               總體(ti) 積                            50 μl
 

輕彈管底將溶液混合，6 000 rpm短暫離心。
 

3.  管家基因反應體(ti) 係：
 

序號            反應物                                劑量

1      SYBR Green 1 染料                   10 μl

2      內(nei) 參照上遊引物F                         0.5 μl

3     內(nei) 參照下遊引物R                         0.5 μl

4               dNTP                                    0.5 μl

5               Taq酶                                   1 μl

6      待測樣品cDNA                             5 μl

7              ddH₂O                                  32.5 μl

8             總體(ti) 積                                    50 μl
 

輕彈管底將溶液混合， 6000 rpm短暫離心。
 

3.  製備好的陽性標準品和檢測樣本同時上機，反應條件為(wei) ：93℃　2分鍾，然後93℃ 1分鍾，55℃ 2分鍾，共40個(ge) 循環。
 

五、 製備用於(yu) 繪製梯度稀釋標準曲線的DNA模板
 

1.  針對每一需要測量的基因，選擇一確定表達該基因的cDNA模板進行PCR反應。
 

2.  反應體(ti) 係
 

序號                     反應物                        劑量

1                     10× PCR緩衝(chong) 液            2.5 ul

2                           MgCl2 溶液              1.5 ul

3                           上遊引物F                 0.5 ul

4                           下遊引物R                0.5 ul

5                            dNTP混合液            3 ul

6                            Taq聚合酶               1 ul

7                             cDNA                       1 ul

8                    加水至總體(ti) 積為(wei)               25 ul
 

輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
 

35個(ge) PCR循環（94℃1分鍾；55℃1分鍾；72℃1分鍾）； 72?C延伸5分鍾。
 

（3）PCR產(chan) 物與(yu) DNA Ladder在2％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測PCR產(chan) 物是否為(wei) 單一特異性擴增條帶。
 

（4）將PCR產(chan) 物進行10倍梯度稀釋: 將PCR產(chan) 物進行10倍梯度稀釋: 設定PCR產(chan) 物濃度為(wei) 1×10¹⁰，依次稀釋至10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴幾個(ge) 濃度梯度。
 

六、 待測樣品的待測基因實時定量PCR

1.  所有cDNA樣品分別配置實時定量 PCR反應體(ti) 係。

2.  體(ti) 係配置如下：（信帆生物提供實驗中所需的所有試劑，老師提供樣本即可）
 

序號             反應物                                劑量

1            SYBR Green 1 染料               10 ul

2                上遊引物                               1 ul

3                下遊引物                               1 ul

4                  dNTP                                   1 ul

5              Taq聚合酶                               2 ul

6             待測樣品cDNA                        5 ul

7                   ddH2O                              30 ul

8                   總體(ti) 積                               50 ul
 

輕彈管底將溶液混合，6 000 rpm短暫離心。
 

（3）將配製好的PCR反應溶液置於(yu) Realtime PCR儀(yi) 上進行PCR擴增反應。反應條件為(wei) ：93℃ 2分鍾預變性，然後按93℃ 1分鍾，55℃1分鍾，72℃1分鍾，共40做個(ge) 循環，zui後72℃7分鍾延伸。
 

七、 實時定量PCR使用引物列表
 

引物設計軟件：上海信帆生物提供免費的引物設計與(yu) 合成服務，並遵循以下原則：引物與(yu) 模板的序列緊密互補；引物與(yu) 引物之間避免形成穩定的二聚體(ti) 或發夾結構；引物不在模板的非目的位點引發DNA 聚合反應(即錯配)。
 

八、電泳
 

各樣品的目的基因和管家基因分別進行Realtime PCR反應。PCR產(chan) 物與(yu) DNA Ladder在2％瓊脂糖凝膠電泳，GoldView染色，檢測PCR產(chan) 物是否為(wei) 單一特異性擴增條帶。