免疫熒光實驗代測，免疫熒光代測，免疫熒光

免疫熒光實驗代測，免疫熒光代測，免疫熒光找上海信帆生物

上海信帆生物代做免疫熒光實驗。老師提供樣本即可，我司可以進行蠟塊切片可提供抗體(ti) 等。免疫熒光檢測我們(men) 分單標和雙標。

一、服務介紹

免疫熒光細胞化學是根據抗原抗體(ti) 反應的原理，先將已知的抗原或抗體(ti) 標記上熒光素製成熒光標記物，再用這種熒光抗體(ti) （或抗原）作為(wei) 分子探針檢查細胞或組織內(nei) 的相應抗原（或抗體(ti) ）。在細胞或組織中形成的抗原抗體(ti) 複合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標本，熒光素受激發光的照射而發出明亮的熒光（黃綠色或桔紅色），可以看見熒光所在的細胞或組織，從(cong) 而確定抗原或抗體(ti) 的性質、定位，以及利用定量技術測定含量。

二、實驗原理

將不影響抗原抗體(ti) 活性的熒光色素標記在抗體(ti) （或抗原）上，與(yu) 其相應的抗原（或抗體(ti) ）結合後，在熒光顯微鏡下呈現一種特異性熒光反應。

三、實驗流程

免疫熒光單標記方法

免疫熒光單標記是指隻標記一種蛋白質分子，方法比較簡單，隻要按照染色步驟去做，通常不存在太多的問題。但要注意固定液的選擇，固定液選擇的合適與(yu) 否，可能會(hui) 直接影響染色結果。具體(ti) 染色方法如下。

1、所需材料與(yu) 試劑

a, 培養(yang) 在蓋玻片或玻璃培養(yang) 皿中融合程度達到60%-70%的細胞。

b, 一抗、FITC或TRITC標記的二抗。

c, 4%多聚甲醛固定液或冷丙酮固定液 (-20℃預冷20 min)。

d, 封閉液。

e, 0.01mol／LPBS緩衝(chong) 液。

2、染色方法

a, 取出培養(yang) 有細胞的蓋玻片或glass-bottom培養(yang) 皿，用0.01MPBS洗2-3遍。

b, 加入0.3%的Tritonx-100, 37℃, 30 rain

c, 加入4%多聚甲醛試問固定30 min或冷丙酮4℃固定10 min。

d，正常阻斷血清1:20封閉試問20-30 min，抑製IgG的非特異性結合。阻斷血清必須選擇與(yu) 二抗同一種屬的正常血清。

e, 去掉正常血清，直接加入一抗，37℃孵育1 h或4℃過夜。抗體(ti) 以0.01 mo/LPBS稀釋(理想的抗體(ti) 濃度需經試驗而定)。

f, 0.3% TritonX-100洗5 min，0.01 mol/IPBS洗5 min，0.3% TritonX 5 min，0.01 M PBS洗5 rain。

g, 加入FITC-二抗或TRITC-二抗，37℃，孵育1h。

h, 0.3%TritonX-100洗5rain，0.01 mol/LPBS洗5min，0.3% Triton X 5min，0.01mol/LPBS洗5 min，用濾紙吸幹。

i, 90%甘油(PBS配製)封片。

j, 激光掃描共焦顯微鏡下觀察，或於(yu) 4℃避光保存。

免疫熒光雙標記方法

免疫熒光的雙標記是指同時標記細胞內(nei) 兩(liang) 種蛋白質分子，當懷疑某種配體(ti) 與(yu) 已知受體(ti) 結合後可用此方法加以證明。此方法稍微複雜一些，首先應注意所用的一抗必須是來自不同種屬動物的兩(liang) 種特異性抗體(ti) (例如：A抗體(ti) 為(wei) 多克隆抗體(ti) ，來自家兔；B抗體(ti) 為(wei) 單克隆抗體(ti) ，來自小鼠)。其次，兩(liang) 種二抗所帶熒光素的發射光不應重疊，且盡量遠離，通常可以選擇FITC和TRITC、Alex488和TRITC、FITC和Cy5，或Cy3和Cy5等來組合。通常情況下，染色時兩(liang) 種一抗可以同時孵育，然後可以同時孵育兩(liang) 種二抗。但當染色結果一種顏色非常弱，而另一種顏色比較強時，應考慮先孵育顏色較弱的二抗。其他步驟同免疫熒光單標記。

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實驗操作注意事項：

1、熒光染色後一般在1h內(nei) 完成觀察，或於(yu) 4℃保存4h，時間過長，可能會(hui) 使熒光提前衰退。

2、每次試驗均需設置以下三種對照：

(1) 陽性對照：陽性血清+熒光標記物;

(2) 陰性對照：陰性血清+熒光標記物;

(3) 熒光標記物對照：PBS+熒光標記物。

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