Western Blot技術服務實驗流程

Western Blot實驗流程

1、蛋白質抽提

A、實驗對象為(wei) 組織樣品，取適量（250-500mg）新鮮組織樣品，加1ml含蛋白酶抑製劑的總蛋白抽提試劑（或核蛋白抽提試劑），勻漿後抽提總蛋白。

B、實驗對象為(wei) 細胞樣品，每份樣品取1×106～1×107細胞，PBS清洗細胞，去PBS加0.1ml~1ml含蛋白酶抑製劑的總蛋白抽提試劑（或核蛋白抽提試劑）抽提總蛋白。

2、蛋白質定量

按KCTMBCA蛋白質定量試劑盒操作說明操作，測定樣品濃度。

3、變性聚丙烯酰胺不連續凝膠電泳(SDS-PAGE)

將準備好的樣品液和生物素標記的蛋白質分子量標準分別上樣，標準加進*個(ge) 孔中，電泳分離蛋白。

4、蛋白質轉移到硝酸纖維膜或PVDF膜

5、膜的封閉和抗體(ti) 孵育

A、膜在5％BSA溶液中室溫孵育1小時以封閉膜上的非特異結合。

B、封閉過的膜加入一級抗體(ti) 室溫孵育1.5小時，抗原抗體(ti) 結合。

C、加入HRP標記的二級抗體(ti) 以結合一級抗體(ti) 及HRP標記的抗生物素抗體(ti) 以結合分子量標準，室溫孵育膜1小時。加入HRP標記的GAPDH抗體(ti) 可同時檢測GAPDH含量。

6、結果檢測

化學發光法檢測，膜與(yu) 化學發光底物孵育，經X膠片曝光顯影。圖片掃描保存為(wei) 電腦文件，並用ImageJ分析軟件將圖片上每個(ge) 特異條帶灰度值的數字化。

7、數據分析

目的蛋白的灰度值除以內(nei) 參GAPDF的灰度值以校正誤差，所得結果代表某樣品的目的蛋白相對含量。

8、提供實驗報告

包括詳細的實驗方法及Western Blot實驗結果。

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