重組質粒的轉化、篩選和鑒定分析

一、實驗目的

   1、學習(xi) 克隆工作中zui常用的雙酶切； 2、學習(xi) 將外源基因與(yu) 質粒連接方法及操作技術； 3、學習(xi) 氯化鈣法製備大腸杆菌(Escherichia coli)感受態細胞的技術； 4、了解細胞轉化的概念及其在分子生物學研究中的意義(yi) 。 5、外源質粒DNA轉入受體(ti) 菌細胞的技術以及篩選轉化體(ti) 的技術。 6、學習(xi) 鑒定重組子的方法。

二、 實驗原理

   重組子的建立：采用雙酶切質粒載體(ti) pBR322和pUC18，酶切後產(chan) 生了互補的粘性末端，在T4 DNA 連接酶的作用下，兩(liang) 個(ge) 質粒片段連接。 感受態細胞(Competent cells)：受體(ti) 細胞經過一些特殊方法（如：CaCl，RuCl等化學試劑法）的處理後，細胞膜的通透性發生變化，成為(wei) 能容許多有外源DNA的載體(ti) 分子通過的感受態細胞(competent cell) 。
    轉化（transformation）：是將異源DNA分子引入一細胞株係，使受體(ti) 細胞獲得新的遺傳(chuan) 性狀的一種手段，是基因工程(Genetic Engineering)等研究領域的基本實驗技術。

   電轉化法：使用低鹽緩衝(chong) 液或水洗製備的感受態細胞，通過高壓脈衝(chong) 的作用將載體(ti) DNA分子導入受體(ti) 細胞。

   克隆的篩選：主要用不同抗生素(antibiotic)基因篩選。常用的抗生素(antibiotic)有：氨苄青黴素、卡那黴素、氯黴素、四環素、鏈黴素等；

   重組質粒克隆的鑒定：鑒定帶有重組質粒克隆的方法常用的有α-互補、小規模製備質粒DNA進行酶切分析、插入失活、PCR以及雜交篩選的方法。

   zui常用的方法是小規模製備質粒DNA進行酶切分析，對於(yu) 帶有LacZ基因的載體(ti) 還可以結合α-互補現象來篩選。

三、試劑與(yu) 器材

   1、試劑 pUC18質粒，pBR322質粒，DL2000 Marker, Pst I(15U/ul)及酶切緩衝(chong) 液, EcoR I(15U/ul)及酶切緩衝(chong) 液，DNA Ligation Kit Ver 2.1 (TaKaRa)，LB液體(ti) 培養(yang) 基(Luria-Bertani) ，LB固體(ti) 培養(yang) 基，50mg/ml卡那黴素(kanamycin)儲(chu) 存液，質粒快速提取試劑盒（博大泰克），10 X Buffer K， Pst I，EcoR I (TaKaRa) 2、器材 電基因轉移議，恒溫搖床，台式高速離心機，恒溫水浴鍋， 瓊脂糖凝膠電泳裝置，電熱恒溫培養(yang) 箱，電泳儀(yi) ，超淨工作台， 微量移液槍，eppendorf管。

四、操作方法

   1．構建重組質粒 質粒pUC18和pBR322分別用Pst I和EcoR I雙酶切，將酶切產(chan) 物按照1：1的比例混合，使用T4 DNA連接酶連接，構建成重組質粒。 2．製備感受態大腸杆菌(Escherichia coli)細胞 收集大腸杆菌(Escherichia coli)細胞，采用CaCl2 處理，製備成感受態細胞。 3．重組子的轉化 將構建的重組質粒加入到製備的感受態細胞懸浮液中，電擊法將重組質粒轉化到宿主細胞中。 4．重組子的篩選鑒定 采用藍白篩選重組子。酚快速抽提質粒，酶切後電泳鑒定。

五、關(guan) 鍵步驟與(yu) 注意事項

   2．連接反應溫度選擇要適中，過高粘末端之間形成氫鍵不穩定，過低會(hui) 影響連接酶的活性。 3．連接反應兩(liang) 種質粒的比例為(wei) 1：1，否則容易自連。 4．製備感受態細胞時要采用對數生長期初期的細胞，低溫處理時間要足夠。 5．電擊法時電擊電壓、電流、時間選擇要合適。 6．轉化及藍白篩選要作陰、陽性對照，防止出現假陽性、假陰性。