Trizol,RNA提取試劑盒現貨熱賣，歡迎聯係

Trizol,RNA提取試劑盒現貨熱賣，歡迎

Trizol 使用說明書(shu)
描述：TRIzol 是一種快速從(cong) 組織細胞中提取總RNA 的單相試劑。在樣品裂解過程中TRIzol 能夠抑製RNA 酶
活性保持RNA 完整性；加入氯仿後離心，RNA 相將與(yu) DNA 和蛋白質分離，隨後用異丙醇沉澱RNA。如果需要
還可以繼續提取DNA 和蛋白質。純化的總RNA 可用於(yu) RT－PCR、Northern Blot、RNA 酶保護、Poly(A) mRNA
純化、體(ti) 外翻譯等實驗。
儲(chu) 存: 4 oC 密封避光保存兩(liang) 年有效。
適用: (1) 固體(ti) 組織(100 mg /ml ): 人、動物、植物的各種新鮮或凍存組織。
(2) 培養(yang) 細胞(5~10 x 106 細胞/ml): 真核細胞，細菌，酵母。
(3) 液體(ti) 標本(100 μl/ml): 全血、體(ti) 液、尿液，病毒樣品等。
操作準備：
極微量的RNA 酶都會(hui) 導致RNA 降解。分離RNA 時RNA 酶汙染主要來自以下五個(ge) 方麵：(1) 實驗人員的雙手。
(2) 器皿、吸頭離心管、自備液體(ti) 。(3) 組織細胞破碎不可避免地釋放的內(nei) 源RNA 酶。(4) RNA 未能*與(yu)
蛋白質分離。(5) RNA 沉澱和溶解時來自吸頭離心管和溶液。Trizol 可抑製RNA 酶活性, 因此在有Trizol
存在的步驟中，使用高壓消毒20 分鍾的吸頭離心管和溶液即可勝任RNA 提取操作。然而在RNA 溶解之後，
來自實驗材料的RNA 酶汙染將會(hui) 導致RNA 降解，應嚴(yan) 格使用高壓滅活RNA 酶的用品。戴手套無疑是有益的，
但戴口罩和帽子則無必要。
1. 固體(ti) 組織破碎設備。準備下列裝置之一，1)玻璃勻漿器。必要時泡酸清潔，用高壓滅菌蒸餾水洗滌數次。
2)研缽。適用於(yu) 液氮凍存組織的研磨，清洗方法同玻璃勻漿器。3)組織細胞超聲破碎儀(yi) 器。探頭插入裝
滿蒸餾水的試管或燒杯中，開啟超聲清洗探頭30 秒至1 分鍾。4)高速機械勻漿器(Polytron，Tekmar
或類似產(chan) 品)。打開開關(guan) ，在蒸餾水中清洗分散器頭數次。
2. 高壓蒸汽30 分鍾消毒一次性吸頭離心管。RNA 沉澱和溶解之後，應嚴(yan) 格使用高壓消毒的一次性用品。
由於(yu) 不可預測的原因，如：動物已經處死，組織已取出，細胞已收取，而吸頭和離心管尚未高壓處理。
此時保險做法是使用普利萊基因技術公司的另種產(chan) 品――組織RNA 保護液(Cat# R1030)，用戶可把來不
及處理的標本保存在RNA 保護液中，37 oC 保存3 天，25 oC 保存2 周，4 oC 保存4 周，－20 oC 保存數
月，固體(ti) 或液體(ti) 標本中RNA 不會(hui) 降解。
3. DEPC 處理的雙蒸水。加DEPC 到水中至終濃度為(wei) 0.01% v/v，室溫過一夜，高壓消毒30 分鍾。用於(yu) 溶解
RNA，配製TE 緩衝(chong) 液和75％乙醇。
4. 普通雙蒸水。高壓消毒30 分鍾，用於(yu) 衝(chong) 洗器皿，配製瓊脂糖凝膠和電泳用緩衝(chong) 液。注意溶液配製後高
壓滅菌，但瓊脂糖不能高壓處理。
5. 冰盒和濕冰。在冰上進行操作有助於(yu) 減少RNA 降解。
6. 異丙醇，氯仿，純乙醇，分析純。75％乙醇用高壓消毒的蒸餾水配製。
7. 其它用品。電泳槽，雙蒸水衝(chong) 洗。離心機和加樣器，無需處理。
8. 戴手套。注意某些實驗如提取質粒DNA 使用大量RNA 酶，為(wei) 防汙染須特別清洗實驗器具和實驗區域。
RNA 提取程序：
1. 組織細胞破碎與(yu) 裂解
冰上操作快速破碎組織至關(guan) 重要。組織細胞過量不僅(jin) 使RNA 得率下降，還將導致DNA 和蛋白質汙染。
(1) 固體(ti) 組織。按比例每50-100 mg 組織加1 ml Trizol 試劑。用研缽研磨：僅(jin) 適用於(yu) 液氮凍存組織。
組織放在研缽中研成粉末，加1 ml Trizol 試劑，繼續研磨至組織*裂解。用玻璃勻漿器勻漿：加入Trizol
上下手動勻漿組織10-15 次。用高速機械勻漿器：將組織放入塑料試管內(nei) ，試管置冰浴燒杯中，加入Trizol
試劑，將分散器頭垂直插入管內(nei) 與(yu) 組織塊接觸，轉速12,000-20,000 rpm，上下移動試管10-20 次，直到組
織*打散，無肉眼可見大塊。用超聲儀(yi) ：根據機器型號進行預試驗，選取能有效破碎組織的功率和時間。
注意：(1)由於(yu) Trizol 的性能，通常用50-100 mg 組織可獲得足量的RNA，對絕大多數實驗目的綽綽有
餘(yu) 。加入過量組織或過少Trizol 容易導致提取失敗。(2)少量難以打碎的組織碎片不影響後續RNA 提取。(3)
用研缽和玻璃勻漿器勻漿破碎組織時，應略微多加一些裂解液，以補充裂解產(chan) 物粘在容器壁上造成的體(ti) 積丟(diu)
失。
(2) 培養(yang) 細胞。貼壁細胞：棄培養(yang) 基，用PBS 緩衝(chong) 液衝(chong) 洗細胞一次。每5-10?106 個(ge) 細胞加1 ml Trizol
試劑，但Trizol 加入量必須有效地覆蓋瓶皿的細胞表麵。一個(ge) 75 cm2 瓶皿的細胞通常需要2 ml 提取液，
一個(ge) 35 cm2 瓶皿的細胞需要1 ml 提取液，更小的培養(yang) 瓶皿可使用更少的提取液，但後續操作會(hui) 因體(ti) 積過小
而極為(wei) 不便。晃動或用吸頭吹打使提取液流過並裂解所有細胞。置冰上5 分鍾，傾(qing) 斜瓶皿使粘稠的裂解物聚
於(yu) 一處以便取出。懸浮細胞：低速離心收集細胞，將細胞快速重懸於(yu) 50-100?l 的PBS 或去離子水中，每
5-10?106 細胞加1 ml Trizol 裂解。注意直接裂解未重懸的細胞沉澱，裂解物將十分粘稠而難以分散。細菌
酵母：離心收集沉澱，加入50-100?l 去離子水重懸細胞。每107 細胞加入1-2 ml Trizol 直接裂解。某些
細菌和酵母細胞可能需要勻漿破碎。
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(3) 液體(ti) 標本：如體(ti) 液、尿液、全血。每100?l 液體(ti) 樣品加1 ml Trizol，置冰上1-3 分鍾。未抗凝
的凝固血液按固體(ti) 組織處理。Trizol Liq (Cat# R1020)產(chan) 品專(zhuan) 門用於(yu) 液體(ti) 標本RNA 提取。
2. 將組織細胞裂解物轉移到1.5 ml 離心管，置冰上10 分鍾。
優(you) 化步驟：如果組織裂解物含較多的碎片，或提取植物組織，12,000g 4 oC 離心10 分鍾，取上層裂解液，
棄管底碎片和粘稠DNA。如果提取脂肪組織，12,000g 4 oC 離心10 分鍾，小心吸掉zui上麵的油層，棄去。
再取裂解液，棄管底碎片和粘稠DNA。取出的裂解液如帶少量油滴不影響提取。
3. 加入0.2 體(ti) 積的氯仿(0.2ml)，充分顛倒混勻，冰上孵育1-5 分鍾，溶液開始分相。有時分相不明顯，
不影響提取。
4. 離心12,000 ? g 4 oC 10 分鍾，溶液分為(wei) 兩(liang) 相。RNA 在上層水相，下層為(wei) 有機相，兩(liang) 相界麵是一層薄膜
其厚度與(yu) 組織細胞類型和多少有關(guan) 。小心吸出0.5ml 上層水相轉移到新離心管。
注意：取上清液時應保留0.5-1 mm 厚的水相，以免擾動和吸入下麵的碎片和有機相。如果吸入，應
將所取的上清液放回管中並重新離心10 分鍾，再次吸取水相。這一點至關(guan) 重要，違背此原則容易
導致RNA 降解和DNA 汙染。如需同時提取DNA 或蛋白質，則保留中間相和下層有機相，向公司
索要操作方法。
5. 加入等體(ti) 積異丙醇(0.5ml)於(yu) 上清液充分混勻。冰上孵育10 分鍾沉澱RNA。用更低的溫度和更長的時間
進行沉澱並不必要。如果起始組織細胞的量很少，－20 oC 放置一至數小時可沉澱幾乎所有的RNA。
注意：從(cong) 富含多糖的植物組織或富含糖原的動物肝髒組織提取RNA 時，按以下步驟進行：以每1 ml Trizol
裂解組織，加氯仿後離心得到約0.5 ml 上清液計算，分別加入上清液一半體(ti) 積即0.25 ml 的高鹽溶液(0.8
M 檸檬酸鈉和1.2 M NaCl)和0.25 ml 異丙醇，混勻。執行下麵的離心沉澱步驟6。離心後可有效沉澱RNA，
但多糖或糖原存留在上清可被棄去。從(cong) 富含多糖的植物和動物肝髒組織提取RNA 時，推薦使用植物RNA 分離
試劑Plant Trizol 或Plant RNA Extraction Kit。
6. 12,000 g，4 oC 離心10 分鍾。管底可見少許RNA 沉澱。
注意：如初始組織細胞量少，RNA 將附著在管壁，用肉眼幾乎難辨沉澱，但不影響實驗。如RNA 沉澱量很多
並呈膠凍狀，通常表明有蛋白汙染。應仔細檢查操作步驟。
7. 棄上清。立即加入1 ml 75%乙醇，顛倒混勻數次洗滌沉澱。12,000 g 離心5 分鍾。棄上清，盡量*
吸去管壁上的液體(ti) 。
注意：乙醇洗滌後RNA 沉澱容易漂浮，勿倒掉或吸走RNA 沉澱。RNA 沉澱在75%乙醇中可在4 oC
保存一周或在－20 oC 保存一年。
8. 敞開管口，空氣幹燥5-10 分鍾使殘留液體(ti) 揮發，RNA 略微沉澱幹燥即可。用50-100 ?l 自備的DEPC 處
理的高壓消毒純水或TE 溶解沉澱。RNA 溶液可保存於(yu) －70 oC 或液氮中。
注意：過分幹燥將使RNA 難以溶解。55 oC 加熱或反複凍融數次可以助溶。RNA 溶液加3 倍體(ti) 積乙醇凍存於(yu)
－20 oC，用時離心沉澱。
說明：
1. 每100 mg 組織RNA 預期得率為(wei) ：肝脾60－100 ?g, 腎50 ?g, 腦組織10-15 ?g, 胎盤20－40 ?g, 脂
肪50 ?g。1 x 107 個(ge) 細胞通常得50－100 ?g。
2. 測定OD 值，根據OD260 計算RNA 濃度。OD260/280 比值可初步判斷RNA 質量，比值在1.6-2.0 之間均
屬正常。起始組織量過大，或吸取了有機相或碎片，將使RNA 樣品中蛋白和雜質含量高，RNA 沉澱乙醇
洗滌不充分(步驟8)，均可導致OD260/280 比值降低。例如，RNA 用水溶解或pH 偏酸OD260/280 偏低，
用TE 或離子強度較高的溶液溶解時較高，但均不影響RNA 後續使用。切記即便是已降解的RNA，
OD260/280 比值也能達到看似的2.0 左右，因此該比值並非判斷RNA 降解與(yu) 否*的指標。判斷RNA
質量的*途徑是進行普通RNA 瓊脂糖電泳檢查RNA 完整性。
3. 檢查RNA 完整性。取1 ?g RNA 樣品進行1%普通瓊脂糖凝膠電泳。溴化乙錠染色，紫外燈觀察。28S RNA~5
kb 亮度應該約為(wei) 18S RNA~2 kb 的兩(liang) 倍，有時可見0.1-0.3 kb 的5S RNA。
4. 調整RNA 溶液的體(ti) 積或重沉澱RNA。(1) 加入適量DEPC 處理過的高壓消毒純水或TE 緩衝(chong) 液，於(yu) RNA 溶
液中，使溶液體(ti) 積補齊到約400 ?l；(2) 加入0.1 體(ti) 積的3M 醋酸鈉pH 5.2，混勻；(3) 加入2.5
體(ti) 積的純乙醇，混勻；(4) 冰上孵育10 分鍾；(5) 12,000g 4 oC 離心10 分鍾，棄上清；(6) 執行上
述RNA 提取程序的步驟6－8。
5. Trizol 勿直接接觸皮膚和吸入。如接觸皮膚，立即用大量水清洗。