ELISA實驗代測之：如何控製好ELISA實驗操作過程

ELISA實驗代測之：如何控製好ELISA實驗操作過程

操作過程的控製：

⑴ 嚴(yan) 格按照試劑說明書(shu) 進行操作。操作前將試劑在室溫下平衡30～60min。

⑵ 加樣後及時放人孵箱。標本較多時，要分批操作。按說明步驟嚴(yan) 格控製操作時間，防止孵育時間人為(wei) 延長，導致非特異性結合緊附於(yu) 反應孔周圍，難以清洗*。

(3)封板溫育時，各孔一定要封嚴(yan) ，防止陽性標本的液體(ti) 蒸發，產(chan) 生周邊現象從(cong) 而導致“花板”的出現。

(4)用洗板機洗板時，保證洗液注滿各孔，洗板針暢通，洗完板後在吸水紙(選擇幹淨、無或少塵的吸水材料)上輕輕拍幹：還要防止針口有纖維蛋白或異物，這些異物在洗板的過程中易產(chan) 生拖帶現象而導致“花板”的出現。

(5)合理安排檢測量，以免反應板過多造成洗板等待時間長。

(6)加酶試劑後用吸水紙在酶標板表麵輕拭吸幹。

(7)顯色劑盡量在臨(lin) 用前配製，堅持不用過期顯色劑，肉眼可見淺藍色的TMB顯色劑不用。

(8)加樣時保持顯色劑不外流;A、B液應避免接觸金屬器械。加終止液時應避免產(chan) 生氣泡。

(9)應保證C清潔，整個(ge) 操作過程中保證酶標板不接觸次氯酸。以上的措施可以使“花板”降至zui低限度。從(cong) 而提高檢測的特異性。並得到更準確、可靠的實驗結果。

加樣吸嘴的潔淨與(yu) 否和吸量的準確性，直接影響檢測結果。由於(yu) 吸嘴構造特殊，導致清洗困難，加大了交叉汙染的機會(hui) 。建議用一次性吸嘴。加樣器也要經常清洗，定期校準。加樣時應將所加物加在 ELISA 板孔的底部，避免加在孔壁上部，並注意不可濺出。

溫浴影響，在建立 ELISA 方法作反應動力學研究時，實驗表明，兩(liang) 次抗原 抗體(ti) 反應一般在37℃經1-2 小時，產(chan) 物的生成可達。為(wei) 避免蒸發，板上應加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，反應板不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。應注意溫育的溫度和時間應按規定力求準確。由於(yu) 公司的 試劑 盒溫育是在空氣浴中完成，采用水浴會(hui) 造成值偏高或花板。另外溫育中還有邊緣效應，邊上的值會(hui) 偏高，建議為(wei) 了客觀的判斷結果，將質控放在非邊緣位置。96孔酶標板結構特別;易產(chan) 生邊緣效應，抗原抗體(ti) 結合及酶促反應對溫度有嚴(yan) 格要求，酶標板周圍與(yu) 內(nei) 部孔升降溫速率不同，造成周邊與(yu) 內(nei) 部孔結果差異;幹浴與(yu) 水浴存在明顯的差異，盡可能使用水浴，並要求固相板放入水中，減少受熱不均，貼密封膜，防止汙物浸入。

洗滌在 ELISA 過程中雖不是一個(ge) 反應步驟，但卻決(jue) 定著實驗的成敗。ELSIA 就是靠洗滌來達到分離遊離的和結合的酶標記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與(yu) 固相抗原或抗體(ti) 結合的物質，以及在反應過程中非特異性地吸附於(yu) 固相載體(ti) 的幹擾物質。聚苯乙烯等塑料對蛋白質的吸附是普遍性的，而在洗滌時應把這種非特異性吸附的幹擾物質洗滌下來。可以說在ELISA 操作中，洗滌是zui主要的關(guan) 鍵技術，應引起操作者的高度重視，操作者應嚴(yan) 格按要求洗滌，不得馬虎。

洗滌液多為(wei) 含非離子型洗滌劑的中性緩衝(chong) 液，各種 試劑 盒的洗液不要混用。聚苯乙烯載體(ti) 與(yu) 蛋白質的結合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團，也含親(qin) 水基團，其疏水基團與(yu) 蛋白質的疏水基團借疏水鍵結合，從(cong) 而削弱蛋白質與(yu) 固相載體(ti) 的結合，並借助於(yu) 親(qin) 水基團和水分子的結合作用，使蛋白質回複到水溶液狀態，從(cong) 而脫離固相載體(ti) 。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20，其濃度可在0.05%-0.2%之間，高於(yu) 0.2%時，可使包被在固相上的抗原或抗體(ti) 解吸附而減低試驗的靈敏度。洗液需要稀釋，應按要求稀釋。配製洗液應用新鮮的和高質量的純化水，電導率小於(yu) 1.5μs/cm，洗液如果結晶應待其融解後配製。手洗條件一致性較差，對結果影響較大，防止洗液在孔內(nei) 形成氣泡。半自動與(yu) 全自動冼板機使用不當也會(hui) 影響結果，血清中殘留的的纖維蛋白絲(si) 或洗滌液析出的結晶易使洗板機針小孔全阻塞或半阻塞狀態，造成未結合標記酶洗脫不*，導致“花板”造成假陽性或假陰性;所以操作洗板機過程中要不時觀察洗板機針孔內(nei) 洗液的通暢狀況，及時糾正，洗板機不用時應用去離子水清冼幾遍。

保證洗板浸泡時間為(wei) 40 秒左右，孔內(nei) 液體(ti) 被洗板機吸得越幹淨洗滌效果更好，手工洗板！

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