ky体育在线登陆測定錯誤結果的原因分析

ELISA即酶聯免疫吸附試驗，是一種常用的固相酶免疫測定方法。Engvall 和Perlmann於(yu) 1971年zui先應用該法進行了IgG定量測定，並命名為(wei) "enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)"。 ELISA的基本原理是：①使抗原（或抗體(ti) ）結合到某種固相載體(ti) 表麵，並保持其免疫活性；②使抗原（或抗體(ti) ）與(yu) 某種酶聯結成酶標抗原（或抗體(ti) ），而且此酶標抗原（或抗體(ti) ）既保留其免疫活性，又保留其酶活性；③測定時將受檢標本（抗體(ti) 或抗原）和酶標抗原（或抗體(ti) ）按不同步驟與(yu) 固相載體(ti) 表麵的抗原或抗體(ti) 進行反應，再用洗滌方法使固相載體(ti) 上形成的抗原抗體(ti) 複合物與(yu) 其它物質分開，zui後結合在固相載體(ti) 上的酶量與(yu) 標本中受檢的抗體(ti) 或抗原量成一定比例；再加入酶反應底物後，底物被酶催化後變為(wei) 有色產(chan) 物，根據其顏色反應的深淺進行定性或定量分析，以了解被測標本中抗體(ti) 或抗原含量。 

ELISA方法被廣泛應用於(yu) 各種抗原和抗體(ti) 測定。但ELISA測定中影響因素較多，而且其操作中有一定的技術要求，在研究檢驗中除正常反應外，有時常可見到一些錯誤結果（即假陽性或假陰性結果）。引起ELISA測定錯誤結果的原因主要有：①標本因素；②試劑因素；③操作因素。本文就標本因素對ELISA測定的影響做如下討論。

血清是zui常用的ELISA標本，血漿一般可視為(wei) 與(yu) 血清同等的標本，標本引起的假陽性和假陰性結果主要是幹擾性物質所致，分為(wei) 內(nei) 源性物質和外源性物質兩(liang) 種：

1． 內(nei) 源性物質
有人認為(wei) 大約40%的科研血清標本中含有非特異性幹擾物質，可以不同程度影響檢測結果。常見的幹擾物質有：類風濕因子、補體(ti) 、嗜異性抗體(ti) 、嗜靶抗原自身抗體(ti) 、醫源性誘導的抗鼠Ig (s)抗體(ti) 、交叉反應物質和其它物質等。

（1）類風濕因子 科研血清中IgM、IgG型類風濕因子（RF）可以與(yu) ELISA係統中的捕獲抗體(ti) 及酶標記二抗的FC段直接結合，從(cong) 而導致假陽性。解決(jue) 該情況的辦法是：①用F(ab)2替代完整的IgG；②標本用聯有熱變性（63℃，10 min）IgG的固相吸附劑處理（將熱變性IgG加入到標本稀釋液中同樣有效）；③檢測抗原時，可以用2-巰基乙醇等加入到標本稀釋液中，使RF降解。

（2）補體(ti)  ELISA係統中固相一抗和標記二抗過程中，抗體(ti) 分子發生變構，其FC段的補體(ti) C1q分子結合位點被暴露出來，使C1q 可以將二者連接起來，從(cong) 而造成假陽性。解決(jue) 的辦法是：①用EDTA稀釋標本；②用53℃，10 min或56℃，30 min加熱血清使C1q滅活。

（3）嗜異性抗體(ti)  人類血清中含有能與(yu) 齧齒類動物（如鼠等）Ig (s) 結合的天然嗜異性抗體(ti) ，可將ELISA係統中一抗和二抗連接起來，也能造成假陽性。解決(jue) 的辦法是：可在標本稀釋液中加入過量的動物Ig (s) ，但加入量不足或亞(ya) 類不同時無效。

（4）嗜靶抗原的自身抗體(ti)  抗甲狀腺球蛋白、抗胰島素等嗜靶抗原的自身抗體(ti) ，有時能與(yu) 靶抗原結合形成複合物，在ELISA方法中均可幹擾抗原抗體(ti) 測定結果。為(wei) 避免以上情況出現，解決(jue) 的辦法是：測定前需用理化方法將其解離後再測定。

（5）醫源性誘導的抗鼠Ig (s) 抗體(ti)  研究開展的用鼠源性CD3等單克隆抗體(ti) 治療，用放射性同位素標記鼠源性抗體(ti) 的影像診斷及靶向治療等新技術，均有可能使這些病人體(ti) 內(nei) 產(chan) 生抗鼠抗體(ti) ；另外，被鼠等齧齒類動物咬傷(shang) 的樣本體(ti) 內(nei) 也可以產(chan) 生抗鼠Ig (s) 抗體(ti) 。這些樣本ELISA測定時均可產(chan) 生假陽性。解決(jue) 的辦法是：測定抗原時，在標本中加入足量的正常鼠Ig (s) ，從(cong) 而克服由於(yu) 上述原因造成的假陽性。

（6）交叉反應物質 類地高辛、類AFP樣物質等，是與(yu) 靶抗原有交叉反應的物質。在用多抗測定抗原時對測定結果影響不大，但在用單克隆抗體(ti) 測定抗原時，如果交叉抗原決(jue) 定簇正好是所用單克隆抗體(ti) 相對應的靶決(jue) 定簇時，也會(hui) 出現假陽性結果。

（7）標本中其它成分的影響 血清脂質過高、膽紅素、血紅蛋白及血液粘度過大等，均對ELISA測定結果有幹擾作用。

2． 外源性物質
外源性物質常常是由於(yu) 用於(yu) ELISA測定的血標本的采集、貯存等不當所致。如標本溶血、標本被細菌汙染、標本貯存過久、標本凝集不全和采血管中添加物等影響。

（1）標本溶血 由於(yu) 各種人為(wei) 原因引起的標本溶血，均可因紅細胞破壞溶解時釋放出大量具有過氧化物酶活性的血紅蛋白，在以辣根過氧化物酶為(wei) 標記的ELISA測定中，會(hui) 導致非特異性顯色，幹擾測定結果。為(wei) 克服上述幹擾作用，標本采集時必須注意避免溶血。

（2）標本受細菌汙染 因菌體(ti) 中可能含有內(nei) 源性辣根過氧化物酶，因此，被細菌汙染的標本同溶血標本一樣，亦可產(chan) 生非特異性顯色而幹擾測定結果。 

（3）標本保存不當 在冰箱中保存過久的標本，血清中IgG可聚合成多聚體(ti) 、AFP可形成二聚體(ti) ，在間接法ELISA測定中會(hui) 導致本底過深、甚至造成假陽性；標本放置時間過長（如一天以上），有時抗原或抗體(ti) 免疫活性減弱，亦可出現假陰性。為(wei) 克服上述幹擾，ELISA測定的血清標本宜為(wei) 新鮮采集；如不能立即測定，5天內(nei) 測定的血清標本可存放於(yu) 4℃，1周後測定的血清標本應低溫凍存；凍存後融解的標本，蛋白質局部濃縮，分布不均，應充分混合後再測定，但混勻時應輕柔，不可強烈振蕩。

（4）標本凝集不全 在沒有促凝劑和抗凝劑存在的情況下，正常血液采集後1/2~2h開始凝固，18~24h*凝固。研究檢驗工作中，有時為(wei) 了爭(zheng) 取時間快速檢測，常在血液還未開始凝固時即強行離心分離血清，此時的血清中仍殘留部分纖維蛋白原，在ELISA測定過程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊，易造成假陽性結果；這類情況於(yu) 次日複查時因血凝已*，血清中不再有纖維蛋白原存在，故複查結果變為(wei) 陰性。為(wei) 避免上述幹擾作用，解決(jue) 的辦法是血液標本采集後必須使其充分凝固後再分離血清，或標本采集時用帶分離膠的采血管或於(yu) 采血管中加入適當的促凝劑。

（5）標本管中添加物質的影響 抗凝劑（如肝素，EDTA）、酶抑製劑（如NaN3可抑製ELISA係統中辣根過氧化物酶活性）及快速分離血清的分離膠等均對ELISA測定有一定幹擾作用。

綜上所述，對研究檢驗ELISA測定中出現的假陽性或假陰性結果，在考慮試劑因素和操作因素之外，更多的應從(cong) 標本因素方麵進行分析，並應采取相應措施排除幹擾作用，從(cong) 而為(wei) 研究提供正確可靠的檢測結果。