信帆生物代做免疫組化代測，免疫組化試劑盒，免疫組化操作步驟

免疫組化代測，免疫組化試劑盒，免疫組化操作步驟
　

　一 免疫組化（LP 法）操作步驟

　　1． 切片常規脫蠟至水。如需抗原修複，可在此步後進行

　　⒉ 緩衝(chong) 液洗 3min/2 次。

　　⒊ 為(wei) 了降低內(nei) 源性過氧化物酶造成的非特異性背景染色，將切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分鍾。

　　⒋ 緩衝(chong) 液洗 5min/2 次。

　　⒌ 滴加 Ultra V Block ， 在室溫下孵育 5 分鍾以封閉非特異性的背景染色。

　　（注：孵育不要超過 10 分鍾，否則會(hui) 導致特異性染色降低。如果一抗的稀釋液中含有 5 － 10% 正常羊血清，這一步可以省略。）

　　⒍ 緩衝(chong) 液洗 5min/2 次。

　　⒎ 滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 － 2 小時。（具體(ti) 孵育時間和溫度由試驗者zui終決(jue) 定）

　　⒏ 緩衝(chong) 液洗 5min/2 次。

　　9 ． 滴加 Primary Antibody Enhancer（增強子），在室溫下孵育 20 分鍾。

　　10 ．緩衝(chong) 液洗 5min/2 次。

　　11 ．滴加 HRP Polymer（酶標二抗） ，在室溫下孵育 30 分鍾。

　　（注：HRP Polymer 對光敏感，應避免不必要的光暴露並儲(chu) 存在不透明的小瓶中。）

　　12 ．緩衝(chong) 液洗 5min/2 次。

　　13 ．向 1ml DAB Plus Substrate （或 AEC Plus Substrate) 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen （或 AEC Plus Chromogen），混勻後滴加到切片上，孵育 3 － 15 分鍾。（具體(ti) 時間由染色深淺決(jue) 定。）

　　14 ．自來水充分衝(chong) 洗，複染，脫水，透明，封片。

二．免疫組化主要步驟
1. 洗載玻片:將載玻片置於(yu) 重鉻酸鉀和濃H2SO4混合液中,目的是為(wei) 了是載玻片上的矽膠等除去,同時使一些肉眼看不見的凹凸不平的表麵變平整,便於(yu) 組織吸附,然後置於(yu) 清水中清洗,除去殘餘(yu) 的重鉻酸鉀和濃H2SO4(大約衝(chong) 一個(ge) 小時左右),再將載玻片浸泡於(yu) 酒精之中, 然後放到架子上,置於(yu) 37°C溫箱中，將多聚賴氨酸塗布於(yu) 玻片的表麵，由於(yu) Lys帶正電，而大多數的組織帶負電荷，從(cong) 而產(chan) 生吸附作用。
2. 包埋組織:先在鐵模具中加入一些液態石蠟，先稍微冷卻，然後再將待包埋的組織置於(yu) 石蠟之中，並排列整齊，再將塑料模具盒蓋上，zui後加入少許液體(ti) 石蠟，進行冷凍，使石蠟變成固態。
3.切片：將包埋好的組織從(cong) 模具上取下來，並置於(yu) 石蠟切片機上，切片機通過調節上下左右來來使組織和切割方向一致，然後調節切片的厚度，一般為(wei) 5µm,如果比較難切，則可以適當調整厚度，用毛筆將切割的載玻片向外拉，並用小鑷子將包含有完整組織的載玻片置於(yu) 40°C溫水中。
4. 撈組織：當組織載玻片置於(yu) 40°C溫水中之前，要先將水浴中的氣泡趕走，以免氣泡受熱上浮而貼到組織上，組織受熱展開，是組織不起皺紋，用載玻片撈組織時，一般取載玻片的下1/3或者下1/2一般每種組織撈5-6張，其中2-3張是備用的，每張載玻片上通常撈兩(liang) 份組織，做對照使用，這樣形成的誤差就比較小了，而且撈載玻片的時候方向一致，以便觀察，再將撈出來的載玻片置於(yu) 架子上，放入37°C溫箱中烘幹。
5. 脫蠟：依次將載玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精，起脫蠟作用的主要是二甲苯,依據的是相似相溶的原理.一般在每個(ge) 試劑中放10min,天氣熱可以少放幾分鍾,相反,天氣較冷的話,就要適當延長脫蠟時間,一般為(wei) 12-15min.
6.抗原修複：脫蠟後在清水中衝(chong) 洗一段時間，加入3%H2O2浸泡10min，從(cong) 而除去內(nei) 源性的過氧化氫酶，然後倒掉H2O2，在清水中洗兩(liang) 次，再加入檸檬酸緩衝(chong) 液，放入微波爐中蒸煮3min（中火），一般剛到沸騰即可，冷卻至室溫，然後再蒸煮一次，冷卻至室溫，蒸煮的目的是為(wei) 了使抗原的位點暴露出來。
7.血清封閉：冷卻至室溫後，將檸檬酸緩衝(chong) 液倒掉，水洗2次，並將載玻片置於(yu) PBS中5min，洗2次，擦幹組織周圍的PBS液，馬上加上血清，使一些非特異性的位點封閉起來，然後放入37°C溫箱中半小時。血清稀釋10倍（900µlPBS：100µl血清封閉液）。
8. 加一抗：將溫箱中的載玻片取出，用吸水紙擦幹載玻片反麵和正麵組織周圍的血清，加一抗，如果做對照實驗，就在對照的組織上加PBS。加完一抗後於(yu) 4°C冰箱中保存過一夜。
9. 加二抗：將載玻片從(cong) 冰箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦幹組織周圍的PBS後加上二抗,然後置於(yu) 37°C溫箱中半小時。
10. 加SABC:將片子從(cong) 溫箱中取出, 放入PBS中洗3次，每次5min，擦幹組織周圍的PBS後加上SABC, 然後置於(yu) 37°C溫箱中半小時。SABC稀釋100倍（990µlPBS：10µlSABC）。
11. 加顯色劑：將片子從(cong) 溫箱中取出, 放入PBS中洗3次，每次5min，擦幹組織周圍的PBS後加上顯色劑。（顯色劑的配置：在1ml水中加1滴顯色劑A，搖勻，然後加1滴顯色劑B，搖勻，再加1滴顯色劑C，搖勻）

 A：DAB        B：H2O2        C：磷酸緩衝(chong) 液
12. 複染：將顯色後的片子用清水衝(chong) 洗一段時間後，浸泡於(yu) 蘇木精中染色，一般動物組織為(wei) 半分鍾，植物組織3-5min。
13. 脫水：將複染後的片子置於(yu) 水中衝(chong) 洗後，依次將載玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。每個(ge) 試劑中放置2min，zui後浸泡在二甲苯中，搬到通風櫃中。
14. 封片：用中性樹膠滴在組織旁邊，再用蓋玻片蓋上，要先放平一側(ce) ，然後輕輕放下另一側(ce) ，以免產(chan) 生氣泡，封好片子後置於(yu) 通風櫃中晾幹。

三. 免疫組化染色步驟

　　冰凍切片 4-8um ，室溫放置 30 分鍾後，入 4 ℃丙酮固定 10分鍾，PBS洗，5分鍾x3，用過氧化氫孵育5-10分鍾，消除內(nei) 源性過氧化物酶的活性。

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