上海信帆：PCR實驗代測，PCR實驗

多聚酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction, PCR）是美國 Perkin-Elmer/Cetus公司人類遺傳(chuan) 研究室Mullis K. B.等人於(yu) 1985年發明的一種快速體(ti) 外DNA片段擴增技術，是八十年代分子生物學資源領域的一項革命性突破，被譽為(wei) 分子生物學資源發展*的又一裏程碑。該技術一問世，就在分子生物學、醫學、生物工程、法醫學、考古學等領域得到快速而廣泛的應用，並且對已建立的基因克隆、DNA序列分析等現代分子生物學技術的發展也起了巨大的推動作用。 
        PCR技術是一種模擬自然DNA複製過程的體(ti) 外酶促合成特異性核酸片段技術（亦稱無細胞分子克隆技術）。它以待擴增的兩(liang) 條DNA鏈為(wei) 模板，由一對人工合成的寡核苷酸作為(wei) 介導，通過DNA聚合酶促反應，在體(ti) 外進行特異DNA序列擴增。其過程包括模板變性（denature）、引物退火（annealing）和用DNA聚合酶延伸（clongation）退火引物在內(nei) 的重複循環係列，使末端被引物5’端限定的特異性片段成指數形式累積。由於(yu) 在每一循環中合成的引物延伸產(chan) 物可作為(wei) 下一循環中的模板，因而每次循環中靶DNA的拷貝數幾乎呈幾何級數增長。因此20次PCR循環將產(chan) 生約一百萬(wan) 倍（220）的擴增產(chan) 物，具有操作簡單、快速、靈敏度高、特異性強的特點，並且具有從(cong) DNA粗製品和降解的 DNA模板中擴增靶序列的能力，這一點在生藥鑒定應用中尤為(wei) 重要。 
       PCR的原理類似於(yu) DNA的天然複製過程，關(guan) 鍵是運用兩(liang) 個(ge) 起始引物，分別為(wei) 待擴增序列的相對的兩(liang) 條單鏈DNA結合，結合位點分別位於(yu) 待擴增序列的兩(liang) 端，並且3’端相對，然後利用DNA聚合酶依賴於(yu) DNA模板的特性，模仿體(ti) 內(nei) 的複製，在兩(liang) 個(ge) 引物之間誘發聚合酶反應。PCR反應可以簡述如下： 
       在微量離心管中加入適量緩衝(chong) 液，加微量模板DNA，四種脫氧單核苷酸（dNTP），耐熱Taq聚合酶及兩(liang) 個(ge) 合成DNA引物，並有Mg²⁺存在。 
1、加熱使模板DNA在高溫下（95℃左右）變性，雙鏈DNA解開而變成單鏈DNA遊離於(yu) 溶液中。這是所謂變性階段。 
2、PCR的引物是兩(liang) 段人工合成的寡核苷酸鏈，長度為(wei) 16－24個(ge) 核苷酸殘基，其順序由被擴增的DNA片段兩(liang) 端的序列決(jue) 定。這兩(liang) 段寡核苷酸         鏈分別與(yu) 模板DNA的正鏈和負鏈互補，所互補的位點一個(ge) 在被擴增序列的“上遊”，一個(ge) 在被擴增序列的“下遊”。高溫使模板DNA變性成單         鏈以後，溫度降低，由於(yu) PCR反應體(ti) 係中引物的拷貝數遠遠多於(yu) 模板DNA的拷貝數，因而引物與(yu) 模板 DNA形成複合物的機率要大大高於(yu)          模板DNA兩(liang) 條單鏈的重新結合。隻要嚴(yan) 格地控製複性的條件，複性過程是傾(qing) 向於(yu) 形成引物與(yu) 模板的複合物的。這是退火階段。 
3、溶液反應溫度升至中溫（72℃），在Taq酶作用下，以dNTP為(wei) 原料，引物為(wei) 複製起點，模板DNA的一條雙鏈在解鏈和退火之後延伸為(wei) 兩(liang)          條雙鏈。這是延伸階段。 
         如此重複，改變反應溫度，即高溫變性，低溫退火，中溫延伸三個(ge) 階段。這三次改變溫度為(wei) 一個(ge) 循環。每循環一次，使特異區段基因拷貝數擴大一倍，一般30次循環，基因放大數可達2ⁿ倍。可用公式 
      Y＝（1＋X）ⁿ 
 表示，式中Y＝DNA擴增倍數，X＝擴增效率，循環數為(wei) n。 
 如X＝100%，n＝20時，Y＝1048576倍。但實際擴增效率（X）不會(hui) 達到 100%。 

2 試驗條件 
本程序適用於(yu) 自動PCR操作，可適用於(yu) 大多數情況，所用酶是不含核酸外切酶活性的熱穩定聚合酶，如Taq聚合酶等。 
引物（各50pmol） 
0.2mmol/L dNTPs（必須使用高質量的dNTPs，這一點非常重要。dNTPs經反複化凍後會(hui) 發生降解，因此應分成小份保存。應注意混合物中四種dNTP的量要相等） 
模板DNA：約0.05～1mg基因組DNA或0.002～0.02mg質粒DNA 
Taq DNA聚合酶（Perkin Elmer, Norwalk, Connecticut） 
10×PCR緩衝(chong) 液（500mmol/L KCl，15mmol /L MgCl₂，100mmol/L Tris·HCl，pH 8.3） 
礦物油 
電泳所需試劑 

【儀(yi) 器設備】 
PCR擴增儀(yi)  
電泳裝置 
微量離心機 
微量移液器（1～20ml和20～200ml） 
0.5ml Eppendorf 管 
紫外線觀察裝置及照相設備
2.2.2.3 操作程序 
1．在無菌的Eppendorf管內(nei) 加入以下反應物：

2．93℃ 反應2 min後開始以下循環： 
93℃變性反應1 min； 
50℃退火反應1 min； 
72℃延伸反應3 min。 
經過17～35循環後，zui後一個(ge) 循環72℃增加5 min。循環結束後反應產(chan) 物置於(yu) 40℃保存。 
3．取1～5ml反應產(chan) 物走凝膠電泳，經溴化乙錠染色檢測擴增的情況。

2.2.2.4 應注意的問題及其解決(jue) 方法 
1．PCR反應條件的優(you) 化 
要優(you) 化特定的PCR反應，有必要試用不同的反應組分和循環參數。表2-1列出了添加或改變某一試劑濃度對反應結果的影響，從(cong) 中大家可以得到一些線索以改進反應條件，提高PCR產(chan) 量和/或特異性，一般情況下，隻須改變一兩(liang) 個(ge) 參數就行了，如pH值和MgCl₂濃度。表2-2給出了循環參數對PCR結果的影響。 
表2-1 PCR各反應組分濃度對產(chan) 物特異性和產(chan) 量的影響

* 效果可能不可預測
** 添加10% DMSO時，Taq DNA聚合酶的活性會(hui) 被抑製47%，因此反應加大Taq DNA聚合酶的用量（即5U）予以補償(chang)
*** Perkin Elmer, Norwalk, Connecticut
表2-2 可改變以提高PCR產(chan) 物的特異性和/或產(chan) 量的循環參數

* 使用基因組DNA作模板時，開始幾個(ge) 循環變性應於(yu) 97℃進行 
** 假定Tm值為(wei) 60℃ 
*** 延伸時間依產(chan) 物大小而定：1000bp的產(chan) 物延伸30s即可，產(chan) 物更長時，按每1000 bp延伸0.5 min計，在後期循環中增加延伸時間可以提高擴增效率
2．引物的設計 
毫無疑問，引物的堿基組成，長度及其靶序列的同源性是決(jue) 定PCR成敗的首要因素，選擇設計引物在一定程度上仍然要靠經驗，對於(yu) 某一對引物而言尚無通用的規則可嚴(yan) ，但應遵守以下原則： 
（1）一般性原則： 
①長度：15～30bp，其有效長度 [Ln=2 (G+C)+(A+T)] 一般不大於(yu) 38，否則PCR的zui適延伸溫度會(hui) 超過Taq酶的*作用溫度（74℃），從(cong) 而降低產(chan) 物的特異性。 
②G＋C含量：應在45%～55%之間，PCR擴增中的複性溫度一般是較低Tm值引物的Tm值減去5～10度。引物長度小於(yu) 20時，其Tm值等於(yu) 4×(G+C)+2×(A+T)。 
③ 堿基分布的隨機性：應避免連續出現4個(ge) 以上的單一堿基。尤其是不應在其3’端出現3個(ge) 的連續的G或C，否則會(hui) 使引物在G＋C富集序列區錯誤引發。 
④ 引物自身：不能含有自身互補序列，否則會(hui) 形成發夾樣二級結構。 
⑤引物之間：兩(liang) 個(ge) 引物之間不應有多於(yu) 4個(ge) 的互補或同源堿基，不然會(hui) 形成引物二聚體(ti) ，尤應避免3’端的互補重疊。 
⑥特異性：與(yu) 非特異擴增序列的同源性應小於(yu) 70%，或少於(yu) 連續8個(ge) 的互補堿基。 
（2）引物的3’端： 
引物的3’端很大程度上影響Taq酶的延伸效應，除特殊情況（AS-PCR）外，3’端不應發生錯配。S. Kwok等發現，引物的3’端發生錯配時，A:A使產(chan) 量下降至1/20，A:G或C:C下降至1/100。當末位堿基是T時，即使錯配也能引發鏈的合成，而為(wei) A時錯配的引發效率zui低，G、C居間。 
因此，引物的3’端堿基選用A、G、C，而盡可能地避免選用T，尤應避免連續出現2個(ge) 以上的T。 
此外，如果擴增編碼區域，引物的3’端不要終止於(yu) 密碼子的第3位，因此處易發生簡並，從(cong) 而影響擴增特異性。 
（3）避開引物的二級結構區： 
某些引物無效的原因是引物重複區二級結構的影響，因此選擇擴增片段時應注意避開二級結構區，有些計算機軟件可幫助確定該區域，如不能避開，則可用7- deaza-2’-脫氧GTP取代dGTP，有助於(yu) PCR成功。 
目前在引物選擇中已廣泛應用計算機軟件，從(cong) EMBL或Genebank中查找有關(guan) 基因序列，並依據上述原則對所選用引物進行評價(jia) 。 
3．出現異常結果時的解決(jue) 思路 
在做PCR反應的過程中，由於(yu) 其酶促反應的本質，影響zui終結果的因素較多，所以出現一些非預料的結果是可以理解的。下麵簡單地總結一下在PCR反應結果出現異常時我們(men) 應該采取的措施。 
（1）電泳檢查沒有 PCR產(chan) 物 
a．需檢查一下Taq DNA聚合酶是否失活，或是活性太低，還需查一下在加樣過程中是否向體(ti) 係中加過Taq DNA聚合酶； 
b．需檢查一下所使用的引物，看其序列設計是否正確，是否堿基組成不平衡； 
c．需要檢查一下PCR反應過程中模板是否變性充分，尤其在前幾個(ge) 循環中是否變性充分；可以適當地提高模板變性的溫度或是適當延長變性的時間；  
d．需檢查一下在PCR反應體(ti) 係中是否有Taq DNA聚合酶的抑製劑，如SDS汙染等等； 
e．需檢查一下模板中是否有蛋白酶和核酸酶的汙染，可以預先加熱使之失活。 
（2）電泳檢查出現引物二聚體(ti) 區帶 
a．需檢查一下兩(liang) 個(ge) 引物的3’端是否互補，或者是否有相類似的回文結構； 
b．需檢查一下使用的引物是否太短，可以予以適當的延長； 
c．需檢查模板的用量，模板以10－4個(ge) 拷貝為(wei) *，模板太少會(hui) 造成引物相對過量； 
d．適當地降低引物的濃度，引物濃度過高是出現引物二聚體(ti) 的zui主要原因；  
e．循環次數太多也易形成引物二聚體(ti) ，可以適當地減少循環數；  
f．可以將複性溫度提高一些以減少引物二聚體(ti) 形成。  
（3）電泳檢測PCR產(chan) 物呈片狀（smear）  
a．需檢查一下Taq DNA聚合酶的用量，適當地減少Taq酶的量有助於(yu) 特異性條帶擴增；  
b．可以提高反應的退火溫度，或者直接采用兩(liang) 個(ge) 溫度的PCR（68℃退火和延伸，94℃模板變性）；  
c．適當地降低Mg ²⁺ 的濃度也可起到降低非特異性擴增可能性的作用；  
d．適當地減少反應退火的時間和延伸的時間；  
e．適當地減少循環次數也會(hui) 有效果；  
f．可以嚐試使用巢式引物PCR（nested primer PCR）。  
（4）電泳檢測PCR產(chan) 物出現其它非特異性條帶  
a．需檢查一下引物的3’端是否有連續排列的G或C；  
b．可以適當地提高退火溫度或直接采用兩(liang) 步溫度PCR方法進行擴增；  
c．可以降低Taq DNA聚合酶的用量，同時也降低引物的濃度；  
d．可以適當地減少退火所用的時間以及延伸反應的時間；  
e．可以適當地增加或減少一些Mg ²⁺ 濃度。  
4．假陽性  
實驗中設立的陰性對照可提示有無假陽性結果出現。如果一次實驗中的幾個(ge) 陰性對照中出現一個(ge) 或幾個(ge) 陽性結果，提示本次實驗中其它標本的檢測結果可能有假陽性。造成假陽性的原因包括樣品汙染、擴增試劑汙染、擴增產(chan) 物交叉汙染等。常見的汙染來源包括實驗室環境、加樣器、操作中形成的噴霧、DNA抽提儀(yi) 器、試劑及任何與(yu) 擴增產(chan) 物接觸的東(dong) 西。  
預防各種汙染的措施主要有：（1）工作區隔離。（2）改進實驗操作，如在加樣過程中避免試劑飛濺、吸頭離心管使用前高壓處理、試劑分裝成小份一次使用後棄去等。（3）操作程序合理化，如後加陽性對照等。  
交叉汙染的處理方法包括：（1）在DNA模板和多聚酶加入前，紫外線照射反應管內(nei) 容物以破壞汙染的PCR產(chan) 物。一般選用波長254nm照射30min（Nature, 1990, 34:27）。（2）PCR實驗中使用dUTP，而不用dTTP。在擴增前使用UraciⅠN-glycosylase（尿嘧啶糖基化酶）處理可降解交叉汙染的PCR產(chan) 物，而不降解基因組DNA模板，然後熱滅活此酶，再進行擴增反應（Gene, 1990, 93: 125）。美國PE公司提供此類試劑盒（PCR carry-over preventionkit）。（3）在PCR反應前加入一種光化學試劑，反應完成後激活該試劑，光化學試劑可交聯 DNA鏈，使之不能再擴增（Nucleic Acids Res, 1991, 19: 99）。  
2.2.2.5 PCR技術在分子生藥學中的應用  
對於(yu) 生藥學家來說，PCR技術已稱為(wei) 他們(men) 研究生藥的一種嶄新而有力的工具。PCR技術在生藥學中的應用主要有兩(liang) 方麵：①擴增和直接測序或者對屬性特異的DNA序列定性以用於(yu) 係統發育或親(qin) 緣關(guan) 係的分析，也可用於(yu) 鑒定品種；②通過簡單純化從(cong) 複雜生物樣品的混合物中鑒定病原體(ti) 和土壤微生物，用於(yu) 藥用植物的基因工程。 

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