上海信帆酶聯免疫吸附實驗

酶聯免疫吸附實驗

酶聯免疫吸附劑測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）采用抗原與(yu) 抗體(ti) 的特異反應將待測物與(yu) 酶連接，然後通過酶與(yu) 底物產(chan) 生顏色反應，用於(yu) 定量測定。1971年Engvall和Perlmann發表了該方法用於(yu) IgG定量測定的文章，使得1966年開始用於(yu) 抗原定位的酶標抗體(ti) 技術發展成液體(ti) 標本中微量物質的測定方法。

酶聯免疫吸附法（ELISA）的基本原理
①使抗原或抗體(ti) 結合到某種固相載體(ti) 表麵，並保持其免疫活性。
②使抗原或抗體(ti) 與(yu) 某種酶連接成酶標抗原或抗體(ti) ，這種酶標抗原或抗體(ti) 既保留其免疫活性，又保留酶的活性。
在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體(ti) 或抗原）和酶標抗原或抗體(ti) 按不同的步驟與(yu) 固相載體(ti) 表麵的抗原或抗體(ti) 起反應。用洗滌的方法使固相載體(ti) 上形成的抗原抗體(ti) 複合物與(yu) 其他物質分開，zui後結合在固相載體(ti) 上的酶量與(yu) 標本中受檢物質的量成一定的比例。加入酶反應的底物後，底物被酶催化變為(wei) 有色產(chan) 物，產(chan) 物的量與(yu) 標本中受檢物質的量直接相關(guan) ，故可根據顏色反應的深淺刊物定性或定量分析。由於(yu) 酶的催化頻率很高，故可極大地地放大反應效果，從(cong) 而使測定方法達到很高的敏感度。

方法類型和操作步驟
ELISA可用於(yu) 測定抗原，也可用於(yu) 測定抗體(ti) 。該法適於(yu) 測定細胞培養(yang) 上清、血清、血漿及組織液中的樣本，幹擾小可以測到每毫升納克水平的細胞因子（或受體(ti) ）的水平。在這種測定方法中有3種必要的試劑：
①固相的抗原或抗體(ti) ；
②酶標記的抗原或抗體(ti) ；
③酶作用的底物。根據試劑的來源和標本的性狀以及檢測的具備條件，可設計出各種不同類型的檢測方法。

雙抗體(ti) 夾心法
雙抗體(ti) 夾心法是檢測抗原zui常用的方法，操作步驟如下：
（1）將特異性抗體(ti) 與(yu) 固相載體(ti) 連接，形成固相抗體(ti) ：洗滌除去未結合的抗體(ti) 及雜質。
（2）用脫脂奶粉或BSA進行封閉。洗滌除去多餘(yu) 的脫脂奶粉或BSA。
（3）加受檢標本：使之與(yu) 固相抗體(ti) 接觸反應一段時間，讓標本中的抗原與(yu) 固相載體(ti) 上的抗體(ti) 結合，形成固相抗原複合物。洗滌除去其他未結合的物質。
（4）加酶標抗體(ti) ：使固相免疫複合物上的抗原與(yu) 酶標抗體(ti) 結合。*洗滌未結合的酶標抗體(ti) 。此時固相載體(ti) 上帶有的酶量與(yu) 標本中受檢物質的量正相關(guan) 。
（5）加底物：夾心式複合物中的酶催化底物成為(wei) 有色產(chan) 物。根據顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量。
根據同樣原理，將大分子抗原分別製備固相抗原和酶標抗原結合物，即可用雙抗原夾心法測定標本中的抗體(ti) 。

雙位點一步法
在雙抗體(ti) 夾心法測定抗原時，如應用針對抗原分子上兩(liang) 個(ge) 不同抗原決(jue) 定簇的單克隆抗體(ti) 分別作為(wei) 固相抗體(ti) 和酶標抗體(ti) ，則在測定時可使標本的加入和酶標抗體(ti) 的加入兩(liang) 步並作一步（圖15-5）。這種雙位點一步不但簡化了操作，縮短了反應時間，如應用高親(qin) 和力的單克隆抗體(ti) ，測定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體(ti) 的應用使測定抗原的ELISA提高到新水平。
在一步法測定中，應注意鉤狀效應（hookeffect），類同於(yu) 沉澱反應中抗原過剩的後帶現象。當標本中待測抗原濃度相當高時，過量抗原分別和固相抗體(ti) 及酶標抗體(ti) 結合，而不再形成夾心複合物，所得結果將低於(yu) 實際含量。鉤狀效應嚴(yan) 重時甚至可出現假陰性結果。

間接法測抗體(ti)
間接法是檢測抗體(ti) zui常用的方法，其原理為(wei) 利用酶標記的抗抗體(ti) 以檢測已與(yu) 固相結合的受檢抗體(ti) ，故稱為(wei) 間接法。操作步驟如下：
（1）將特異性抗原與(yu) 固相載體(ti) 連接，形成固相抗原：洗滌除去未結合的抗原及雜質。
（2）加稀釋的受檢血清：其中的特異抗體(ti) 與(yu) 抗原結合，形成固相抗原抗體(ti) 複合物。經洗滌後，固相載體(ti) 上隻留下特異性抗體(ti) 。其他免疫球蛋白及血清中的雜質由於(yu) 不能與(yu) 固相抗原結合，在洗滌過程中被洗去。
（3）加酶標抗抗體(ti) ：與(yu) 固相複合物中的抗體(ti) 結合，從(cong) 而使該抗體(ti) 間接地標記上酶。洗滌後，固相載體(ti) 上的酶量就代表特異性抗體(ti) 的量。例如欲測人對某種疾病的抗體(ti) ，可用酶標羊抗人IgG抗體(ti) 。
（4）加底物顯色：顏色深度代表標本中受檢抗體(ti) 的量。
本法隻要更換不同的固相抗原，可以用一種酶標抗抗體(ti) 檢測各種與(yu) 抗原相應的抗體(ti) 。

競爭(zheng) 法
競爭(zheng) 法可用於(yu) 測定抗原，也可用於(yu) 測定抗體(ti) 。以測定抗原為(wei) 例，受檢抗原和酶標抗原競爭(zheng) 與(yu) 固相抗體(ti) 結合，因此結合於(yu) 固相的酶標抗原量與(yu) 受檢抗原的量呈反比。操作步驟如下：
（1）將特異抗體(ti) 與(yu) 固相載體(ti) 連接，形成固相抗體(ti) 。洗滌。
（2）待測管中加受檢標本和一定量酶標抗原的混合溶液，使之與(yu) 固相抗體(ti) 反應。如受檢標本中無抗原，則酶標抗原能順利地與(yu) 固相抗體(ti) 結合。如受檢標本中含有抗原，則與(yu) 酶標抗原以同樣的機會(hui) 與(yu) 固相抗體(ti) 結合，競爭(zheng) 性地占去了酶標抗原與(yu) 固相載體(ti) 結合的機會(hui) ，使酶標抗原與(yu) 固相載體(ti) 的結合量減少。參考管中隻加酶標抗原，保溫後，酶標抗原與(yu) 固相抗體(ti) 的結合可達zui充分的量。洗滌。
（3）加底物顯色：參考管中由於(yu) 結合的酶標抗原zui多，故顏色zui深。參考管顏色深度與(yu) 待測管顏色深度之差，代表受檢標本抗原的量。待測管顏色越淡，表示標本中抗原含量越多。

捕獲法測IgM抗體(ti)
血清中針對某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時存在，後者會(hui) 幹擾IgM抗體(ti) 的測定。因此測定IgM抗本多用捕獲法，先將所有血清IgM（包括異性IgM和非特異性IgM）固定在固相上，在去除IgG後再測定特異性IgM。操作步驟如下：
（1）將抗人IgM抗體(ti) 連接在固相載體(ti) 上，形成固相抗人IgM。洗滌。
（2）加入稀釋的血清標本：保溫反應後血清中的IgM抗體(ti) 被固相抗體(ti) 捕獲。洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質成分。
（3）加入特異性抗原試劑：它隻與(yu) 固相上的特異性IgM結合。洗滌。
（4）加入針對特異性的酶標抗體(ti) ：使之與(yu) 結合在固相上的抗原反應結合。洗滌。
（5）加底物顯色：如有顏色顯示，則表示血清標本中的特異性IgM抗體(ti) 存在，是為(wei) 陽性反應。

應用親(qin) 和素和生物素的ELISA
親(qin) 和素是一種糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每個(ge) 分子由4個(ge) 亞(ya) 基組成，可以和4個(ge) 生物素分子親(qin) 密結合。現在使用更多的是從(cong) 鏈黴菌中提取的鏈黴和素（strepavidin）。生物素（biotin）又稱維生素H，分子量244.31，存在於(yu) 蛋黃中。用化學方法製成的衍生物，生物素－羥基琥珀亞(ya) 胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可與(yu) 蛋白質、糖類和酶等多種類型的大小分子形成生物素化的產(chan) 物。親(qin) 和素與(yu) 生物素的結合，雖不屬免疫反應，但特異性強，親(qin) 和力大，兩(liang) 者一經結合就極為(wei) 穩定。由於(yu) 1個(ge) 親(qin) 和素分子有4個(ge) 生物素分子的結合位置，可以連接更多的生物素化的分子，形成一種類似晶格的複合體(ti) 。因此把親(qin) 和素和生物素與(yu) ELISA偶聯起來，就可大提高ELISA的敏感度。

親(qin) 和素－生物素係統在ELISA中的應用有多種形式，可用於(yu) 間接包被，亦可用於(yu) 終反應放大。可以在固相上先預包被親(qin) 和素，原用吸附法包被固相的抗體(ti) 或抗原與(yu) 生物素結合，通過親(qin) 和素－生物素反應而使生物素化的抗體(ti) 或抗在相化。這種包被法不僅(jin) 可增加吸附的抗體(ti) 或抗原量，而且使其結合點充分暴露。另外，在常規ELISA中的酶標抗體(ti) 也可用生物素化的抗體(ti) 替代，然後連接親(qin) 和素－酶結合物，以放大反應信號。

ELISA 普遍用作非放射性同位素的成鍵化驗. 在這種方法中, 通常標準配體(ti) 是固定的, 通過加入溶液相受體(ti) 或蛋白質來使之成鍵.通過加入與(yu) 受體(ti) 特異性反應的抗體(ti) 來定量成鍵的受體(ti) , 而且zui初抗體(ti) 的量以加入第二種能顯色的抗體(ti) 測量. 第二種抗體(ti) 能識別抗體(ti) 的末端,在其末端的堿性磷酸酯或過氧化物酶等與(yu) 酶發生反應, 從(cong) 而使溶液顯色.