Western Blot免疫印跡實驗代測*開始啦

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estern，也稱Western blot、Western blotting、Western印跡，是用抗體(ti) 檢測蛋白的重要方法之一。Western可以參考如下步驟進行操作。
1. 收集蛋白樣品(Protein sample preparation)
    可以使用適當的裂解液，例如Western及IP細胞裂解液、RIPA裂解液等，裂解貼壁細胞、懸浮細胞或組織樣品。對於(yu) 某些特定的亞(ya) 細胞組份蛋白，例如細胞核蛋白、細胞漿蛋白、線粒體(ti) 蛋白等，可以參考相關(guan) 文獻提取這些亞(ya) 細胞組份蛋白，也可以使用試劑盒進行抽提，例如細胞核蛋白與(yu) 細胞漿蛋白抽提試劑盒
    收集完蛋白樣品後，為(wei) 確保每個(ge) 蛋白樣品的上樣量一致，需要測定每個(ge) 蛋白樣品的蛋白濃度。根據所使用的裂解液的不同，需要采用適當的蛋白濃度測定方法。因為(wei) 不同的蛋白濃度測定方法對於(yu) 一些去垢劑和還原劑等的兼容性差別很大。
2. 電泳(Electrophoresis)
(1) SDS-PAGE凝膠配製
    SDS-PAGE凝膠可以參考一些文獻資料進行配製
(2) 樣品處理
    在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩衝(chong) 液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩衝(chong) 液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩衝(chong) 液可以減小上樣體(ti) 積，在相同體(ti) 積的上樣孔內(nei) 可以上樣更多的蛋白樣品。5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩衝(chong) 液可以參考相關(guan) 文獻資料配製
(3) 上樣與(yu) 電泳
    冷卻到室溫後，把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nei) 即可。
    為(wei) 了便於(yu) 觀察電泳效果和轉膜效果，以及判斷蛋白分子量大小，使用預染蛋白質分子量標準
    電泳時通常推薦在上層膠時使用低電壓恒壓電泳，而在溴酚藍進入下層膠時使用高電壓恒壓電泳。對於(yu) Bio-Rad的標準電泳裝置或類似電泳裝置，低電壓可以設置在80-100V，高電壓可以設置在120V左右。SDS-PAGE可以采用普通的電泳儀(yi) 就可以滿足要求，為(wei) 了電泳方便起見，也可以采用整個(ge) SDS-PAGE過程恒壓的方式，通常把電壓設置在100V，然後設定定時時間為(wei) 90－120分鍾。設置定時可以避免經常發生的電泳過頭。
    通常電泳時溴酚藍到達膠的底端處附近即可停止電泳，或者可以根據預染蛋白質分子量標準的電泳情況，預計目的蛋白已經被適當分離後即可停止電泳。
3. 轉膜(Transfer)
    我們(men) 推薦在Western實驗中選用PVDF膜(FFP36/FFP39)。硝酸纖維素膜(NC膜)(FFN06/FFN09)也可以使用，但硝酸纖維素膜比較脆，在操作過程中特別是用鑷子夾取等過程中容易裂開。膜的使用請參考生物試劑商的推薦使用步驟。
    通常如果使用Bio-Rad的標準濕式轉膜裝置，可以設定轉膜電流為(wei) 300-400mA，轉膜時間為(wei) 30-60分鍾。也可以在15-20mA轉膜過一夜。轉膜時也可以使用多功能電泳儀(yi) (帶定時)(EEP102)。具體(ti) 的轉膜時間要根據目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的轉膜時間越長，目的蛋白的分子量越小，需要的轉膜時間越短。
    在轉膜過程中，特別是高電流快速轉膜時，通常會(hui) 有非常嚴(yan) 重的發熱現象，把轉膜槽放置在冰浴中進行轉膜。
    轉膜的效果可以觀察所使用的預染蛋白質分子量標準，通常分子量zui大的1-2條帶較難全部轉到膜上。轉膜的效果也可以用麗(li) 春紅染色液(P0022)對膜進行染色，以觀察實際的轉膜效果。也可以用考馬斯亮藍快速染色液(P0017)對完成轉膜的SDS-PAGE膠進行染色，以觀察蛋白的殘留情況。
4. 封閉(Blocking)
    轉膜完畢後，立即把蛋白膜放置到預先準備好的Western洗滌液(P0023C)中，漂洗1-2分鍾，以洗去膜上的轉膜液。從(cong) 轉膜完畢後所有的步驟，一定要注意膜的保濕，避免膜的幹燥，否則極易產(chan) 生較高的背景。
    用微型台式真空泵(EVAC06/EVAC07)或滴管等吸盡洗滌液，加入Western封閉液(P0023B)，在搖床上緩慢搖動,室溫封閉60分鍾。對於(yu) 一些背景較高的抗體(ti) ，可以4℃封閉過一夜。在整個(ge) Western過程中我們(men) 推薦使用側(ce) 擺搖床(ESHK02)或類似儀(yi) 器，側(ce) 向擺動速度比較緩慢，而且也容易讓溶液覆蓋蛋白膜。
5. 一抗孵育(Primary antibody incubation)
    參考一抗的說明書(shu) ，按照適當比例用Western一抗稀釋液(P0023A)稀釋一抗。
    用微型台式真空泵或滴管等吸盡封閉液，立即加入稀釋好的一抗，室溫或4℃在側(ce) 擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。如果一抗孵育一小時效果不佳，可以4℃緩慢搖動孵育過一夜。或更據抗體(ti) 的說明選擇適當的孵育溫度和時間。
    回收一抗。加入Western洗滌液(P0023C)，在側(ce) 擺搖床上緩慢搖動洗滌5-10分鍾。吸盡洗滌液後，再加入洗滌液洗滌5-10分鍾。共洗滌3次。如果結果背景較高可以適當延長洗滌時間並增加洗滌次數。
    注：Western結果通常需要提供內(nei) 參作為(wei) 對照，通常可以選用Tubulin抗體(ti) (AT819)或Actin抗體(ti) (AA128)，進行內(nei) 參檢測。
6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)
    參考二抗的說明書(shu) ，按照適當比例用Western二抗稀釋液(P0023D)稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗。 二抗需根據一抗進行選擇，例如，一抗是小鼠來源的IgG，則二抗需選擇抗小鼠IgG的二抗，如辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L)(A0216)。
    用微型台式真空泵或滴管等吸盡洗滌液，立即加入稀釋好的二抗，室溫或4℃在側(ce) 擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。
    回收二抗。加入Western洗滌液(P0023C)，在側(ce) 擺搖床上緩慢搖動洗滌5-10分鍾。吸盡洗滌液後，再加入洗滌液洗滌5-10分鍾。共洗滌3次。如果結果背景較高可以適當延長洗滌時間並增加洗滌次數。
7. 蛋白檢測(Detection of proteins)
    參考相關(guan) 說明書(shu) ，使用BeyoECL Plus(P0018)等ECL類試劑來檢測蛋白。壓片可以采用的壓片暗盒(FFC58/FFC83)進行。
    洗片時可以使用X光片自動洗片機。如果沒有自動洗片機，可以用顯影定影試劑盒(P0019/P0020)自行配製顯影液和定影液進行手工洗片。X光片推薦選用柯達原裝的生物實驗柯達X-OMAT BT膠片(FF057/FF081)。
8. 膜的重複利用(Membrane recovery)
    如果蛋白樣品非常寶貴，可以使用Western一抗二抗去除液(P0025)處理蛋白膜，以重複利用蛋白膜。

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