大鼠細胞間粘附分子1檢測試劑盒使用報道：ICAM-1的作用

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細胞間黏附分子-1（ICAM-1）和血管細胞黏附分子-1（VCAM-1）在腦缺血損傷(shang) 炎症過程中起著重要作用。腦缺血後ICAM-1和VCAM-1表達增加；ICAM-1、VCAM-1介導循環中的白細胞與(yu) 內(nei) 皮細胞黏附，進而浸潤到血管外腦實質,導致缺血後炎症；抑製ICAM-1、VCAM-1表達及作用可減輕腦缺血損傷(shang) 。

放射性肺損傷(shang) （Radiation Pulmonary leision，RPL）是胸部腫瘤放射治療和骨髓移植全身照射預處理的常見嚴(yan) 重並發症和劑量限製因素，RPL屬於(yu) 非感染性炎症，一旦發生往往不可逆轉[1]，其發病機製至今尚不清楚，缺乏有效的預測指標和治療手段，成為(wei) 胸部腫瘤得到有效治療的難題。細胞間粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)是一重要的細胞間粘附分子和炎症介質，編號CD54，它參與(yu) 細胞的信號傳(chuan) 導與(yu) 活化，細胞的伸展、移動、生長、分化，炎症、血栓的形成，腫瘤轉移以及創傷(shang) 愈合等一係列重要的生理和病理過程[2]。ICAM-1在RPL中通過介導多形核嗜中性粒細胞(polymorphonuclear, PMN)等白細胞粘附、聚集於(yu) 肺泡區域，是導致肺實質細胞損傷(shang) 及持續細胞因子釋放的關(guan) 鍵因素，有報道表明抗ICAM-1抗體(ti) 可以降低肺損傷(shang) 的程度[3-4]，但目前關(guan) 於(yu) ICAM-1在RPL中的具體(ti) 作用機製及是否可以作為(wei) 減輕放射性肺損傷(shang) 的新靶點尚待進一步研究。本文利用RNA幹擾技術建立ICAM-1基因沉默細胞株以及應用基因芯片技術具體(ti) 從(cong) 細胞與(yu) 基因水平上分析其在RPL中的作用途徑及方式，為(wei) 尋找防治RPL的有效措施提供理論依據和新思路。
　　 [目的]
　　 1.采用60Coγ射線照射建立小鼠放射性肺損傷(shang) 模型，探討ICAM-1及相關(guan) 因子在RPL中的表達變化。
　　 2.構建ICAM-1基因沉默的小鼠肺腺癌細胞株(Lewis lung cell，LLC)，探討ICAM-1基因沉默前後LLC細胞的生物學特性及基因表達譜的變化。
　　 3.探討ICAM-1基因沉默對LLC細胞輻射敏感性的影響。
　　 [方法]
　　 1.采用照射劑量為(wei) 16Gy的60Coγ射線全肺單次照射建立小鼠放射性肺損傷(shang) 模型，HE染色法觀察小鼠肺組織損傷(shang) ，免疫組化及Elisa法測定小鼠肺ICAM-1、轉化生長因子-β1(TGFβ1)及腫瘤壞死因子-α（TNF-α)的表達變化。
　　 2.①針對ICAM-1mRNA序列，篩選、設計並合成shRNA相關(guan) 基因片段，構建3條高特異性的 shRNA表達載體(ti) pRNAT-U6.1/Neo-ICAM1-shRNA，采用酶切及DNA測序法驗證插入序列的正確性。
　　 ②脂質體(ti) 法質粒轉染LLC細胞，遺傳(chuan) 黴素G418抗性篩選獲得陽性克隆。RT-PCR和Western blot法檢測shRNA對ICAM-1基因的沉默效率。
　　 ③應用倒置顯微鏡觀察ICAM-1基因沉默前後細胞形態變化，繪製生長曲線分析細胞生長分裂差異，采用MTT比色分析法測定其增殖活性，基因芯片技術分析LLC細胞中ICAM-1基因下調後全基因組表達譜的變化，篩選可能與(yu) ICAM-1信號通路有關(guan) 的差異基因，尋找ICAM-1信號通路的傳(chuan) 導過程以及其在肺癌細胞增殖、遷移調控中的可能分子機製。
　　 3.采用照射劑量為(wei) 4Gy的60Coγ射線照射ICAM-1基因沉默LLC細胞株，MTT法檢測輻照對其增殖活力的影響，集落形成率試驗檢測其對輻照敏感性的變化，流式細胞儀(yi) 檢測輻照對其細胞凋亡與(yu) 周期的影響，探討ICAM-1在輻照後的小鼠肺腺癌LLC細胞株中的作用機製。
　　 [結果]
　　 1.與(yu) 對照組比較，照射組的小鼠至照射後隨時間延長出現精神萎靡，反應遲鈍，毛發有明顯脫落現象，肺呈充血水腫、不均質;肺泡壁增厚，炎性細胞浸潤明顯;肺組織中ICAM-1及其相關(guan) 蛋白TGF-β1表達量明顯增加(P＜0.01，P＜0.05)，TNF-α表達量有所增加，但與(yu) 對照組比較無統計學差異(P＞0.05)。
　　 2.①經酶切和DNA測序鑒定，成功構建了3條靶向抑製小鼠ICAM-1基因及一條陰性對照的 shRNA真核表達載體(ti) pRNAT-U6.1/Neo-ICAM1-shRNA。
　　 ②成功篩選穩定抑製ICAM-1表達的*性細胞克隆，RT-PCR及Western blot技術檢測靶細胞在mRNA水平和蛋白水平上ICAM-1的抑製率分別為(wei) 76.79％和79.01％(P＜0.01)。
　　 ③與(yu) 對照組比較，ICAM-1基因沉默組細胞形態發生改變，細胞生長分裂周期延長;MTT結果顯示沉默組細胞增殖活性降低;基因芯片結果提示在沉默組LLC-ICAM1細胞與(yu) 對照組LLC-NC細胞間共有290個(ge) 存在明顯差異表達的基因，其中表達上調的基因有238個(ge) ，下調的基因有52個(ge) 。
　　 3.MTT及集落形成率試驗結果表明ICAM-1基因沉默組對輻照的敏感度下降，在同等劑量的輻照條件下ICAM-1基因沉默組受到輻照後損傷(shang) 程度降低，增殖活性及恢複能力均比對照組增強;流式凋亡結果顯示ICAM-1基因沉默組細胞受到輻照後24h、48h細胞凋亡率均比對照組小，且48h後恢複情況也較對照組好，輻照24h後的細胞周期G2/M期比例明顯增加，48h後比例有所下降但仍比未輻照組高，提示與(yu) 細胞凋亡結果相一致。
　　 [結論]
　　 1.在16Gy60Coγ射線照射建立的小鼠放射性肺損傷(shang) 模型中研究發現，肺組織中ICAM-1蛋白存在異常表達，且與(yu) TGF-β1、TNF-α的表達變化相一致。提示ICAM-1的表達水平的高低可能與(yu) 放射性肺損傷(shang) 具有一定的相關(guan) 性，且與(yu) TGF-β1、TNF-α等細胞因子存在相互作用，可作為(wei) 預測或評價(jia) 放射性肺損傷(shang) 程度的一個(ge) 重要因子。
　　 2.靶向 ICAM-1基因的重組質粒載體(ti) pRNAT-U6.1/Neo-ICAM1-shRNA構建成功，為(wei) 建立ICAM-1基因沉默細胞株及後續研究奠定基礎。
　　 3.成功構建ICAM-1基因沉默細胞株，沉默細胞株的生物特性研究提示ICAM-1可能參與(yu) 細胞增殖等生理活動。
　　 4.利用基因芯片技術分析ICAM-1基因沉默後全基因組表達譜的變化，發現ICAM-1可能通過Bax/Bcl-2、FasL/Fas、MAPK等通路參與(yu) 細胞增殖、凋亡等生理過程。
　　 5.在ICAM-1在照射後LLC細胞株中的作用機製研究試驗結果中，發現幹擾ICAM-1基因的表達，可以明顯降低LLC細胞株的輻射敏感性，增強輻射損傷(shang) 後的恢複力。提示ICAM-1在放射性肺損傷(shang) 中可作為(wei) 基因治療潛在的分子靶點，為(wei) 研究治療提供新的有效的治療策略。