ky体育在线登陆常見問題的原因分析和處理方法（2）

　3操作技術 
　　操作過程的控製：①嚴(yan) 格按照試劑說明操作。操作前將試劑在室溫下平衡30～60 min。②加樣後及時放入孵箱。標本較多時，要分批操作。按說明步驟嚴(yan) 格控製操作時間，防止孵育時間人為(wei) 延長，導致非特異性結合緊附於(yu) 反應孔周圍，難以清洗*。③封板溫育時，各孔一定要封嚴(yan) ，防止陽性標本的液體(ti) 蒸發，產(chan) 生周邊現象從(cong) 而導致“盎”灞的出現。④用洗板機洗板時，保證洗液注滿各孔，洗板針暢通，洗完板後在吸水紙（選擇幹淨、無或少塵的吸水材料）上輕輕拍幹；還要防止針口有纖維蛋白或異物，這些異物在洗板的過程中易產(chan) 生拖帶現象。⑤合理安排檢測量，以免反應板過多造成洗板等待時間長。⑥加酶試劑後用吸水紙在酶標板表麵輕拭吸幹。⑦顯色劑盡量在臨(lin) 用前配製，不使用過期顯色劑，肉眼可見淺藍的TM顯色劑不用。⑧加樣時保持顯色劑不外流；A、B液應避免接觸金屬器械。加終止液時要避免產(chan) 生氣泡。⑨應保證酶標板清潔，整個(ge) 操作過程中保證酶標板不接觸次氯酸。以上的措施可以得到更準確、更可靠的實驗結果。加樣吸嘴的潔淨與(yu) 否和吸量的準確性直接影響檢測結果。由於(yu) 吸嘴構造特殊，導致清洗困難，加大了交叉汙染的機會(hui) 。建議用一次性吸嘴。加樣器也要經常清洗，定期校準。加樣時應將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，並注意不可濺出。 
　　溫浴影響。在建立ELISA方法時做反應動力學研究。實驗表明，兩(liang) 次抗原抗體(ti) 反應一般在37℃經1～2 h，產(chan) 物的生成可達。為(wei) 避免蒸發，板上應加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔。反應板孔、反應板不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。溫育的溫度和時間應嚴(yan) 格按規定控製，特別要注意邊緣位置。96孔酶標板結構特別，易產(chan) 生邊緣效應，抗原抗體(ti) 結合及酶促反應對溫度有嚴(yan) 格要求，酶標板周邊孔與(yu) 內(nei) 部孔升降溫速率不同，造成周邊與(yu) 內(nei) 部孔結果差異；幹浴與(yu) 水浴存在明顯的差異，盡可能使用水浴，並要求固相板放入水中，減少受熱不均，貼密封膜，防止汙物浸入。 
　　洗滌在ELISA過程中雖不是一個(ge) 反應步驟，但卻決(jue) 定著實驗的成敗。ELISA應是靠洗滌來達到分離的和結合的酶標記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與(yu) 固體(ti) 相抗原或抗體(ti) 結合的物質，以及在反應過程中非特異性地吸附於(yu) 固相載體(ti) 的幹擾物質。聚苯乙烯等塑料對蛋白質的吸附是普遍性的，而在洗滌時應把這種非特異性吸附的幹擾物質洗滌下來。可以說在ELISA操作中，洗滌是zui主要的關(guan) 鍵技術，應引起操作者的高度重視，操作者應嚴(yan) 格按要求洗滌，不得馬虎隨意。

　　洗滌液多為(wei) 含非離子性洗滌劑中的中性緩衝(chong) 液，各種試劑盒的洗液不要混用。聚苯乙烯載體(ti) 與(yu) 蛋白質的結合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團，又含親(qin) 水基團，其疏水基團與(yu) 蛋白質的疏水基團借疏水鍵結合，從(cong) 而削弱蛋白質與(yu) 固相載體(ti) 的結合，並借助於(yu) 親(qin) 水基團和水分子的結合作用，使蛋白質恢複到水溶液狀態，從(cong) 而脫離固相載體(ti) 。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20，其濃度為(wei) 0.005%～0.02%，高於(yu) 0.02%可使包被在固相上的抗原或抗體(ti) 借吸附而減低試驗的靈敏度。洗液需要稀釋，應按要求稀釋。配製洗液應用新鮮的和高質量的純化水，電導率小於(yu) 1.5 μs/cm，洗液如果結晶應待其溶解後配製。手洗條件一致性較差，對結果影響較大。半自動與(yu) 全自動洗板機使用不當也會(hui) 影響結果，血清中殘留的纖維蛋白絲(si) 或洗滌液析出的結晶易使洗板機針小孔全阻塞或半阻塞，造成未結合標記酶洗脫不*，導致“花板”，造成假陽性或假陰性。所以操作洗板機過程中要不時觀察洗板機針孔內(nei) 洗液的通暢狀況，及時糾正，洗板機不用時應用去離子水清洗幾遍。 
　　保證洗板浸泡時間為(wei) 40 s左右，孔內(nei) 液體(ti) 被洗板機洗得越幹淨越好。 
　　4顯色和比色 
　　TMB經HRP作用後，約40 min顯色達，隨即逐漸減弱，至2 h後即可*消退至無色。TMB的終止液有多種，疊氮納和十二烷基硫酸鈉（SDS）等酶抑製劑均可使反應終止。這類終止劑尚能使藍色維持較長時間（12～14 h）不褪，是目視判斷的良好終止劑。此外，各類酸性終止液則會(hui) 使藍色轉變為(wei) 橙黃色，此時可用特定的波長（450 nm）測讀吸光值。酶標儀(yi) 的主要性能指標有：測讀速度、讀數的準確性、重複性、度和可測範圍、線性等。優(you) 良的酶標儀(yi) 的讀數一般可到0.001，使用前先預熱儀(yi) 器15～30 min，測讀結果更穩定。 
　　測讀A值時，要選用產(chan) 物的敏感吸收峰，如OPD用492 nm波長。有的酶標儀(yi) 可用雙波長式測讀，即每孔先後測讀兩(liang) 次，*次在zui適波長（W1），第二在不敏感波長（W2），兩(liang) 次測定間不移動ELISA板的位置，zui終測得的A值為(wei) 兩(liang) 者之差（W1-W2）。雙波長式測讀可減少由容器上的劃痕或指印等造成的光幹擾。 
　　肉眼判斷結果時，顯色淺不易觀察，影響結果的準確性，必須使用酶標儀(yi) 檢測，以保結果一致性。 
　　5 HOOK效應 
　　隨著ELISA一步法的應用，一些標本中抗原含量過高，產(chan) 生HOOK效應。影響檢測結果，采用同步稀釋測定或使用線性範圍高的兩(liang) 對半定量法可以減少HOOK反應的發生。 
　　6幹擾物質 
　　有人認為(wei) 大約40%的科研血清標本中含有非特異性幹擾物質，可以不同程度影響檢測結果。常見的幹擾物質有：類風濕因子、補體(ti) 、嗜異性抗體(ti) 、嗜靶抗原自身抗體(ti) 、醫原性誘導的抗鼠Ig(s)抗體(ti) 、交叉反應物質和其他物質等。如RF因子可與(yu) 標記二抗的Fc段結合造成假陽性，補體(ti) 從(cong) C1q活化，使一抗和酶標二抗的抗體(ti) 分子發生變構，Fc的C1q分子結合點暴露出來，則補體(ti) C1q可將二者連接起來造成假陽性，采用56℃ 30 min滅活補體(ti) 可降低假陽性率，高濃度的AFP（如孕婦）在儲(chu) 存過程中可能形成二聚體(ti) ，會(hui) 導致本底過深，影響檢測結果。 
　　7藥物的影響 
　　價(jia) 的乙肝免疫球蛋白會(hui) 與(yu) HBsAg形成複合物，影響HBsAg的檢出，所以一些HBsAg陽性患者注射乙肝免疫球蛋白後，HBsAg檢測會(hui) 呈陰性反應，導致乙肝兩(liang) 對半少見模式的出現。如我們(men) 常遇到乙肝大三陽的孕婦，為(wei) 阻斷乙肝母嬰垂直傳(chuan) 播，在孕第8、9、10月常規注射200 mg乙肝免疫球蛋白，不僅(jin) 影響孕婦HBsAg的檢出，而且其所生的新生兒(er) 常出現HBsAg陰性、HBeAg陽性和HBcAb陽性等少見模式，可能是乙肝免疫球蛋白屬IgG抗體(ti) 與(yu) 通過胎盤進入胎兒(er) 血液中的HBsAg結合形成複合物，則新生兒(er) HBsAg檢測呈陰性，用0.5 mol的鹽酸處理標本1 h可提高檢出率。 
　　為(wei) 預防乙肝，部分HBsAg陰性人群在接種乙肝疫苗後的12周內(nei) ，血清中可檢出HBsAg成分，形成一過性HBsAg陽性，這可能是乙肝疫苗的主要成分HBsAg，有方法能夠把它檢出，如電化學發光法，建議接種乙肝疫苗後1個(ge) 月內(nei) 不應做HBsAg檢測。 
　　8 抗原自身因素 
　　融合蛋白對基因工程抗原特異性的影響以丙肝診斷試劑盒為(wei) 例，因為(wei) 包被的基因工程抗原為(wei) 融合蛋白，包含了來自表達載體(ti) 的一些序列，可以與(yu) 血清中抗大腸杆菌的因子發生反應而產(chan) 生了可疑標本。 
　　少數HBV感染後外周血中不含HBsAg。HBV感染後絕大多數感染者外周血中可出現HBsAg，含量為(wei) 5 μg/ml～600 μg/ml。據文獻報道，到目前為(wei) 止在獻血員中所發現的HBsAg攜帶者zui低含量為(wei) 0.2 ng/ml，含量高者可達2 000 μg/ml以上。但有少部分HBV感染者血清HBsAg測定為(wei) 陰性，如暴發性乙型肝炎、HBV的S基因發生變異等。急性重症乙型肝炎，肝細胞中以合成HBcAg為(wei) 主，很少或不合成HBsAg，從(cong) 而使外周血中無HBsAg。HBV的前S/S基因編碼HBsAg，構成病毒外膜，根據所帶亞(ya) 型決(jue) 定簇的不同分為(wei) adw、adr、ayw和ayr。a決(jue) 定簇具有很高的免疫原性，在HBV的自然感染或注射HBsAg疫苗可引起抗HBs應答。如S基因145密碼子變異使得其原來的甘氨酸被精氨酸替代時，可致a決(jue) 定簇的抗原性發生改變，使機體(ti) 產(chan) 生的抗體(ti) 對變異株無作用，且可引起HBV感染患者血清中同時出現HBsAg和抗HBs。同時乙肝疫苗接種也不能有效預防此類變異病毒的感染。乙型肝炎病毒S基因的變異有自然變異和逃避免疫變異，變異可發生在多個(ge) 部位，而且幾處突變可同時存在，這些變異有助於(yu) 病毒攜帶狀態的持續存在。zui近，有研究表明，前S1區丟(diu) 失突變（氨基酸58～118）是引起HBsAg陰性的HBV感染的重要原因，S啟動子位於(yu) 前S1，是合成HBsAg的調節元件，前S1的丟(diu) 失突變則會(hui) 影響S啟動子的功能，進而影響HBsAg的合成。 
　　總之，的試劑、狀態良好的儀(yi) 器、排除各種影響因素的幹擾和正確的操作是保證ELISA檢測結果準確可靠的必要條件。