抗大鼠胃泌素單克隆抗體的研製

       ky体育亚洲杯為(wei) 了建立能穩定分泌高親(qin) 和力、高特異性抗大鼠胃泌素單克隆抗體(ti) 的雜交瘤細胞株,在對其親(qin) 和力、特異性以及生物學功能進行鑒定的基礎上,克隆抗大鼠胃泌素單克隆抗體(ti) 的重鏈和輕鏈可變區基因,構建抗大鼠胃泌素單鏈抗體(ti) 基因,在大腸杆菌中誘導表達,並對表達產(chan) 物進行初步鑒定。

       以胃泌素合成肽與(yu) 鑰孔戚血藍蛋白的偶聯物為(wei) 免疫原,采用雜交瘤技術建立能穩定分泌高親(qin) 和力抗大鼠胃泌素單克隆抗體(ti) 的雜交瘤細胞株,大量製備並經鹽析、蛋白G親(qin) 和層析獲得純化的單克隆抗體(ti) ,采用SDS-PAGE對抗體(ti) 進行分子量和純度鑒定,間接ELISA法檢測效價(jia) ,雙向瓊脂擴散實驗鑒定類和亞(ya) 類,非競爭(zheng) 酶免疫實驗測定親(qin) 和力,斑點ELISA和免疫組化鑒定特異性,並且分別采用熒光染色法和MTT比色法,研究其對胃泌素/胃泌素受體(ti) 結合的阻斷作用,以及對SGC-7901細胞增殖的抑製作用.在此基礎上,選擇雜交瘤細胞株E8,用TRIZOL試劑提取總RNA,通過RT-PCR,采用小鼠重鏈可變區和輕鏈可變區通用引物,擴增抗體(ti) 可變區基因.通過重疊延伸PCR將兩(liang) 個(ge) 可變區基因通過連接肽基因連接起來,構建單鏈抗體(ti) 基因,克隆到pGEM-T載體(ti) 中,通過酶切、PCR和測序進行鑒定.然後用限製性內(nei) 切酶雙酶切pGEM-gastrin-ScFv質粒和pET-28a(+)質粒,構建pET-gastrin-ScFv重組表達質粒.轉化大腸杆菌BL21(DE3)後,篩選陽性菌株,通過酶切、PCR進行鑒定.陽性菌株經IPTG誘導培養(yang) 後,分離包涵體(ti) ,進行變性和複性處理,通過SDS-PAGE和競爭(zheng) 抑製ELISA對表達蛋白的分子量和活性進行初步鑒定.