上海信帆：SABC免疫組化試劑盒*

產(chan) 品名稱：

SABC(小鼠IgG)-POD kit

產(chan) 品規格：

100-200T

產(chan) 品貨號：

SA0011

產(chan) 品單位：

盒

供貨商：

上海信帆生物

SABC(小鼠IgG)-POD kit

SABC（Strept Avidin-Biotin Complex）法是一種顯示組織和細胞中抗原分布的簡便而敏感的免疫組化染色方法。在實際實驗過程中，其比直接酶標二抗敏感5-10倍，是免疫組化的理想方法。

基本原理

SABC(小鼠IgG)-POD kit

SABC是鏈黴親(qin) 和素-生物素-酶（或者FITC）複合物。

親(qin) 和素（Avidin）存在於(yu) 雞蛋中，分子量67000，是一種堿性蛋白。對生物素有很強的結合力。鏈黴親(qin) 和素是從(cong) 鏈黴菌中提取的一種蛋白質，分子量47000，等電點為(wei) 6.0-6.5，也對生物素有很強的結合力，但其等電點接近中性，明顯消除了原堿性蛋白所引起的非特異性吸附。

生物素活化後，可以標記抗體(ti) 和酶而不影響其活性。再經SABC放大，一分子的抗體(ti) 可以結合幾十分子的酶或者熒光素，從(cong) 而有很強的放大作用。

SABC是專(zhuan) 為(wei) 免疫組化和其他免疫檢測而設計的，用以顯示組織和細胞中抗原分布。鏈黴親(qin) 和素(StreptAvidin)是一種從(cong) 鏈黴菌中提取的蛋白質，同親(qin) 和素一樣，對生物素有*的親(qin) 和力，親(qin) 和素是一個(ge) 堿性蛋白質（IP=10），經改造後可以轉變成中性蛋白質。鏈黴親(qin) 和素等電點接近中性，對組織和細胞的非特異吸附很低，基於(yu) 鏈黴親(qin) 和素的免疫組化方法背景很低。SABC即StreptAvidin—Biotin Complex。SABC大約可形成一百個(ge) 左右的過氧化物酶和五十個(ge) 左右的鏈黴親(qin) 和素所構成的複合物。大量的酶將保證SABC具有很高的敏感性。

SABC(小鼠IgG)-POD kit

自備試劑：

1．粘片劑多聚賴氨酸。

2． 0.01 M PBS（pH7.2-7.4）

3． 0.01M檸檬酸鈉緩衝(chong) 液

4、抗熒光衰減封片劑

實驗步驟:

以石蠟切片熱修複為(wei) 例

1. 切片常規脫蠟至水。3%H2O2室溫5-10分鍾以滅活內(nei) 源性酶（如果FITC，剛可省掉此步）。蒸餾水洗3次。

2．熱修複抗原:將切片浸入0.01M 枸櫞酸鹽緩衝(chong) 液（PH6.0）,電爐或微波爐加熱至沸騰後斷電，間隔5-10分鍾後，反複1-2次。冷卻後PBS（pH7.2-7.6）洗滌1-2次。

3．滴加5%BSA封閉液,室溫20分鍾。甩去多餘(yu) 液體(ti) , 不洗。

4．用稀釋液將一抗（如兔抗IL-10）按一定比例稀釋（稀釋後的一抗4℃可保存一周），也可另行購買(mai) 抗體(ti) 稀釋液。滴加稀釋的一抗，37 ℃ 1小時左右或20℃時2小時左右。也可4℃過業(ye) 。PBS（pH7.2-7.4）洗2分鍾×3次。（一抗的稀釋度、孵育時間和溫度與(yu) 染色強度、背景有直接關(guan) 係。一般來說，陽性染色強度不夠時，可提高一抗濃度和延長孵育時間；背景過高時，可降低一抗濃度和縮短孵育時間。）

5．根據使用量,用稀釋液將生物素化二抗濃縮液按1:100稀釋成工作液(1ml稀釋液加入10ul生物素化羊抗兔IgG濃縮液,混勻即成工作液。此工作液4℃可保存一周).滴加生物素化羊抗兔IgG工作液,20-37℃ 30分鍾。PBS（pH7.2-7.4）洗2分鍾×3次。

SABC(小鼠IgG)-POD kit

如果想用熒光觀察，請接下麵步驟，如果想用DAB顯色，請跳過6-7。

6．根據使用量,用稀釋液將SABC-FITC濃縮液按1:100稀釋成工作液(1ml稀釋液加入10ul SABC-FITC濃縮液，混勻即成SABC-FITC工作液。此工作液4℃可保存一周).滴加SABC-FITC工作液,20-37℃，30分鍾(避光)。PBS（pH7.2-7.4）洗5分鍾×4次。

7．滴加抗熒光衰減封片劑封片。熒光顯微鏡觀察。

如果想用DAB顯色，請接8。

8．根據使用量,用稀釋液將SABC-POD濃縮液按1:100稀釋成工作液(1ml稀釋液加入10ul SABC-POD濃縮液，混勻即成SABC-POD工作液。此工作液4℃可保存一周).滴加SABC-POD工作液,20-37℃，30分鍾。PBS（pH7.2-7.4）洗5分鍾×4次。

9．DAB顯色:根據用量，用PBS（pH7.2-7.4）配製，按1mlPBS加入50ul 20×DAB顯色液A，加入50ul 20×DAB顯色液B 。混勻後加至切片。室溫顯色, 鏡下控製反應時間，一般在5-30分鍾之間。蒸餾水洗滌終止反應。

10．蘇木素輕度複染。脫水,透明,封片。顯微鏡觀察。

對於(yu) 細胞片，常規固定後，PBS漂洗兩(liang) 次，再用0.5%Txiton X-100室溫20分鍾，PBS漂洗兩(liang) 次，3%H2O2（如果FITC，剛可省掉此步）處理15分鍾；PBS漂洗兩(liang) 次，下接上麵第4步。

對於(yu) 冰凍切片，固定後，可用PBS漂洗兩(liang) 次，再接上麵第二步。

注意事項：如果染色背景過高，在SABC反應之後，DAB顯色之前,用加有0.01—0.02% TWEEN-20的PBST（pH7.2-7.4）洗滌切片4次，PBS洗2次，然後DAB顯色。

因為(wei) 免疫組化指標眾(zhong) 多，標本不一，此步驟僅(jin) 作參考。

注意事項：如果染色背景過高，在SABC反應之後，用加有0.01—0.02% TWEEN-20的PBST（pH7.2-7.4）洗滌切片4次，PBS洗2次，然後封片觀察。

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