ky体育在线登陆實驗操作要點談：洗滌是關鍵

免疫分析，比如ELISA，一般包含兩(liang) 個(ge) 或以上的孵育步驟，中間以洗滌隔開。ELISA通常在96孔板中開展，其上包被了結合抗原或抗體(ti) 。在封閉步驟後，包被後的平板首先與(yu) 一抗或抗原孵育。隨後通過一些洗滌步驟去除未結合（低親(qin) 和力）的抗原-抗體(ti) 複合物。接著，平板與(yu) 二抗孵育。這種帶有酶的抗體(ti) 與(yu) 高親(qin) 和力的抗原-抗體(ti) 複合物結合。之後，又是一輪洗滌。zui後是添加底物並檢測信號。

我們(men) 可使用多種底物來檢測zui終的抗原-抗體(ti) 複合物。底物分為(wei) 三類：自然發光、化學發光和熒光。準確說來，ELISA這個(ge) 詞指的是使用自然發光底物的分析。而使用化學發光底物的分析被稱為(wei) Luminescent Immunoassay（LIA），使用熒光二抗的分析被稱為(wei) Fluorescent Immunoassay（FIA）。
優(you) 化ELISA的重點之一在於(yu) 洗滌。洗滌步驟可降低未結合抗體(ti) 所引起的背景信號，從(cong) 而增加分析的信噪比。每一步之間的洗滌確保隻有特異的結合事件被保留，在zui後一步產(chan) 生信號。而不充分的洗滌會(hui) 導致差異和高背景，從(cong) 而帶來不理想的結果。本文將為(wei) 你介紹一些利用自動洗板機來洗滌ELISA平板的技巧。

洗滌參數
一些參數會(hui) 影響洗滌步驟的效果。*個(ge) 主要的參數是洗滌量。自動洗板機會(hui) 分配洗滌液。如果你之前遭遇過高背景，那麽(me) 不要猶豫，將洗滌量調為(wei) 高，是比包被體(ti) 積更高。太少的洗滌液會(hui) 讓一部分分析表麵洗滌不到，從(cong) 而明顯增加背景。所有反應孔的洗滌量必須相同。ELISA板的製造商通常會(hui) 在試劑盒的使用手冊(ce) 中列出包被量。行業(ye) 中通常使用的包被量是200 µl。如果你的試劑盒也是這樣，那麽(me) 製造商可能會(hui) 建議使用300 µl洗滌液進行洗滌，以便清潔整個(ge) 反應孔的壁。一般來說，洗滌量越高，則孵育步驟殘留的抗體(ti) 或抗原量就越少。

洗滌次數的經驗法則
第二個(ge) 影響洗滌效果的主要參數是洗滌循環的量。當然，洗滌次數越多，背景越低。然而，太多次的洗滌會(hui) 降低信號強度，使其難以測定。通常的做法是在每次抗體(ti) 或抗原孵育後重複洗滌三次。不過，ELISA板的製造商會(hui) 對洗滌次數提出建議。一般而言，包被平板需要的洗滌次數比用戶包被的平板要少。對於(yu) 用戶包被的ELISA板，必須優(you) 化洗滌次數。

控製洗滌量和洗滌次數的另一種方法是加入過量的洗滌液。一般來說，96孔板的每個(ge) 孔能容納330至460 µl。不過，有些自動化洗板機可設置程序，分配遠遠超出這個(ge) 量的洗滌液，比如1 ml。它是如何做到的呢？其實很簡單，就是在分液的同時打開吸液功能。換句話說，隨著分液器分配更多的液體(ti) ，抽吸器也將液體(ti) 吸出。這種技術能增加洗滌量，但不會(hui) 溢出到其他孔中。
 

抽吸

另外，還有一些參數會(hui) 影響洗滌步驟的效果。這些參數包括吸液高度和吸入位置，這兩(liang) 者都能調整，以降低背景（殘留量）和差異。
殘留液體(ti) 中包含未結合的抗原或抗體(ti) ，它們(men) 會(hui) 增加背景信號。殘留量越小，殘留液體(ti) 越少，轉移到下一步的幹擾液體(ti) 也就越少。

吸液高度會(hui) 明顯影響殘留量；如果洗滌吸頭與(yu) 反應孔底部的距離稍大，那就會(hui) 讓殘留量急劇增加。反之，如果洗滌吸頭壓著反應孔底部，那麽(me) 也會(hui) 使吸液效率降低，殘留量增加。
目前的洗板機一般使用兩(liang) 種類型的洗頭：剛性和浮動的。浮動洗頭中的吸頭可在洗滌過程中自由上下移動，而剛性洗頭則固定在適當的位置。使用剛性洗頭的洗滌操作在優(you) 化起來更為(wei) 複雜，因為(wei) 你需要非常仔細地調整吸液高度。如果你們(men) 實驗室使用幾種不同的板，那可能會(hui) 很耗時。在使用浮動洗頭時，吸頭會(hui) 降到反應孔的底部。調整高度就不是很重要，因此洗頭會(hui) 下降到底部。

抽吸的位置也對殘留量有著重要影響；如果每個(ge) 孔隻使用一個(ge) 抽吸點（這很常見，因為(wei) 更快），那麽(me) 抽吸的位置需要優(you) 化。*的位置取決(jue) 於(yu) 洗頭的性狀，但它幾乎不在反應孔的中間，即使這是所有洗頭zui常見的默認位置。一般來說，*位置在孔中間與(yu) 孔壁之間的某處。
反應孔的形狀也會(hui) 影響殘留量。C形底（平底圓角）的微孔板一般會(hui) 比那些平底尖角的微孔板殘留量更低。

如果沒有自動洗板機，采用手工洗滌，那麽(me) 也需要注意幾點。使用8道或12道微量移液器，采用倒吸的方法進行洗滌；不同廠家的洗液不宜相互混用。洗板時需保證微孔板平放，將洗滌液注滿各孔，但盡量避免漏液溢液，以每孔300 µl為(wei) 宜；板洗次數一般為(wei) 3次，要保證洗板的浸泡時間，每次浸泡時間一般為(wei) 30-60 秒；盡量減少洗液殘留量，推薦每次洗板後進行拍板，並及時更換吸水紙，避免吸水紙的碎屑粘到反應孔內(nei) 。

ELISA看起來很簡單，但是在實際操作過程中，也不能掉以輕心，還是應該仔細檢查洗滌步驟，才能獲得準確的結果。