給您介紹蛋白純化的三種新工具

      蛋白親(qin) 和標簽是蛋白質組研究中的一個(ge) 關(guan) 鍵性工具，迄今為(wei) 止人們(men) 已經開發出了許多久經考驗的蛋白標簽係統，例如六聚組氨酸、HA、Myc和FLAG等等。盡管這些標簽係統各具特色，但它們(men) 也分別存在著一些缺陷，還不能*研究者們(men) 的需要。

為(wei) 此，Biotechniques雜誌盤點了近期出現的三種新蛋白標簽係統，以便為(wei) 研究者們(men) 提供更大的選擇空間。這三種蛋白標簽係統分別利用了高親(qin) 和力單抗、無機礦物基質、以及能夠剪切標簽的金屬離子。

單克隆抗體(ti) 標簽

日本研究者Yukinari Kato在開發膠質母細胞瘤的治療性抗體(ti) 時，無意中發現了一個(ge) 可用作親(qin) 和標簽的肽段。Podoplanin蛋白是一個(ge) 在惡性癌細胞中高度表達的跨膜蛋白，Kato生成的大鼠單克隆抗體(ti) NZ-1可以靶向該蛋白中一個(ge) 14個(ge) 殘基的肽段。Kato在ELISA實驗中注意到，NZ-1與(yu) podoplanin蛋白的親(qin) 和力特別高，於(yu) 是他與(yu) 大阪大學的Junichi Takagi合作，希望將其開發成為(wei) 一個(ge) 蛋白標簽係統。
研究人員將與(yu) NZ-1結合的podoplanin肽段稱為(wei) PA標簽，並將其與(yu) 現有的其他標簽係統進行比較（FLAG、HA和Myc）。他們(men) 發現，NZ-1和PA標簽之間的親(qin) 和力更高，解離更慢。Takagi嚐試用這一係統來分離，哺乳動物細胞分泌到培養(yang) 基中的重組蛋白。這些重組蛋白的初始濃度較低，比較難於(yu) 分離和純化。

研究人員發現，細胞培養(yang) 液上清中的PA標記蛋白，能夠有效結合NZ-1-瓊脂糖。此外，0.1 mg/ml的PA標簽溶液可以將融合蛋白競爭(zheng) 性的洗脫下來。隨後，Takagi又通過NZ-1-瓊脂糖層析純化了15種不同分子量的分泌蛋白，這些蛋白的純度都超過了95%。
據介紹，這一係統的關(guan) 鍵優(you) 勢在於(yu) ，可以在無損抗體(ti) 柱的情況下很方便的進行再生。研究顯示，高鹽緩衝(chong) 液可以*去除結合在抗體(ti) 上的PA標簽，進行60次結合-洗脫-再生的循環，也不會(hui) 對柱子的結合能力產(chan) 生任何影響。

目前，上述係統還不能兼容人類細胞。“我們(men) 正在晶體(ti) 結構的引導下，設計不識別人類podoplanin的改進版NZ-1，隻保留它與(yu) 標簽肽段的高親(qin) 和力，”Takagi說。他現在正努力將這一標簽係統應用到蛋白質組分析中去，希望能夠用其替代FLAG標簽。

磷灰石基質生物通
人們(men) 常常用固化的抗體(ti) 和金屬離子來純化重組蛋白，不過這些方案並不，存在著金屬離子析出、穩定性低、和成本高等問題。為(wei) 此。Jacobs大學的Marcelo Fernandez-Lahore用無機礦物氟磷灰石，開發了一個(ge) 新的親(qin) 和標簽純化係統。
以磷酸鈣為(wei) 基礎的磷灰石（例如羥磷灰石和氟磷灰石），幾十年來一直被用作生物分子的吸附劑，其優(you) 勢在於(yu) 這種物質既沒有抗原性也沒有細胞毒性。然而，人們(men) 一直未能將它們(men) 用於(yu) 層析法蛋白純化。這是因為(wei) 此前的磷灰石基質“顆粒形狀不規則，而且在某些條件下很容易溶解，”Fernandez-Lahore說。而近期商業(ye) 化的CFT珠（macroporous ceramic fluorapatite）解決(jue) 了上述問題。

Fernandez-Lahore實驗室在這種材料的基礎上，開始尋找與(yu) 氟磷灰石高度親(qin) 和的標簽肽段。研究人員通過噬菌體(ti) 展示篩選，發現肽段KPRSVSG與(yu) CFT的結合能力很強，於(yu) 是他們(men) 決(jue) 定將這個(ge) CFT結合肽段（CBP）開發成為(wei) 蛋白純化的親(qin) 和標簽。

研究團隊在CFT柱層析實驗中發現，由賴氨酸組成的肽段滯留時間更長。於(yu) 是他們(men) 又添加了六個(ge) 賴氨酸，對原本的CBP進行優(you) 化。研究顯示，用這種標簽純化融合蛋白，純度超過了90%。

研究人員指出，與(yu) 使用固化抗體(ti) 或金屬離子的傳(chuan) 統係統相比，CBP/CFT珠組成的係統可以彌補一些缺陷，是蛋白親(qin) 和純化的另一條寶貴途徑。未來，研究人員將會(hui) 用這一係統，對不同大小、不同特性、不同表達係統（例如哺乳動物或酵母表達係統）的蛋白進行測試。Fernandez-Lahore還指出，這一標簽可以“實現可逆的固化，有望應用於(yu) 醫學診斷或細胞分析。”
 

盡管許多蛋白與(yu) 親(qin) 和標簽融合後也能夠正常工作，但不少實驗還是要求去除這些標簽。人們(men) 往往將剪切位點設計在蛋白標簽旁邊，以便用蛋白酶消化時能夠將其切下來。
為(wei) 了進一步簡化這一過程，哥本哈根大學的Niels Erik Møllegaard提出了一個(ge) 有趣的新標簽係統。在該係統中，一個(ge) 分子可以同時實現親(qin) 和結合和蛋白標簽的剪切，這個(ge) 分子就是二價(jia) 鈾酰離子（UO22+）。

Møllegaard及其團隊研究DNA和RNA的鈾酰（uranyl）剪切已經幾十年了。“這種物質的剪切能力在於(yu) 它能與(yu) 磷酸基團高度親(qin) 和，” Mollegaard說。“我們(men) 嚐試用它進行蛋白剪切也有好幾年了。”
四年前研究團隊發現，鈾酰可以在蛋白中對磷酸化的絲(si) 氨酸進行光切割。研究人員隨即想到，可以合成一個(ge) 包含特異性磷酸化位點的標簽，使其與(yu) 固化的鈾酰離子結合，該係統可以在光切割後釋放出純化的無標簽重組蛋白。

Møllegaard決(jue) 定先將這一係統開發成為(wei) C端標簽，因為(wei) 此前的工作顯示鈾酰切割發生在磷酸化絲(si) 氨酸的N端，這樣就可以實現C端標簽的*切除。蛋白酶剪切無法*去除這樣的標簽，因為(wei) 它的剪切發生在識別位點的C端。
研究人員選擇酪蛋白激酶CKII作為(wei) 磷酸化標簽肽段的激酶，因為(wei) 這種酶的磷酸化發生在識別序列N端的絲(si) 氨酸上。他們(men) 設計的標簽序列是SSDDD，其中三個(ge) 天冬氨酸負責與(yu) 鈾酰結合，兩(liang) 個(ge) 絲(si) 氨酸作為(wei) 磷酸化位點。

研究人員將該標簽的 C端與(yu) GFP融合，並在細菌中進行表達，隨後他們(men) 用CKII處理細菌的裂解物。研究顯示，磷酸化隻發生在標簽中的絲(si) 氨酸位點上。在與(yu) 鈾酰- NTA-瓊脂糖珠混合時，磷酸化的GFP-tag與(yu) 瓊脂糖珠發生了有效的特異性結合，而這樣的結合可以被磷酸鈉緩衝(chong) 液洗脫。
為(wei) 了研究鈾酰切割的具體(ti) 情況，研究人員在細胞裂解物中對GFP-tag進行了CKII處理，然後在溶液中加入鈾酰，並進行了UV照射。他們(men) 觀察到，蛋白標簽出現了光依賴性的切除。不過ESI-MS顯示，GFP的zui後一個(ge) 賴氨酸也被切掉了，說明該係統還需要進一步優(you) 化，讓剪切位點更為(wei) 。

現在，Møllegaard正在嚐試對結合在鈾酰- NTA-瓊脂糖珠上的融合蛋白進行光切割，以便將其發展成為(wei) 蛋白分離和標簽切除的一步法係統。“還有許多步驟有待優(you) 化，舉(ju) 例來說，我們(men) 需要優(you) 化紫外線照射，以便在純化柱上進行更有效的光切割，”Møllegaard指出。