人血管生成素4（ANG-4）ky体育在线登陆 實驗指南

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 用於(yu) ELISA測定的研究標本zui為(wei) 常用的是血清（漿）其次為(wei) 唾液、腦脊液、尿液、糞便等標本。血清標本測定的標誌物為(wei) 傳(chuan) 染性病原體(ti) 的抗原和抗體(ti) 、腫瘤標誌物、特種蛋白時，在處理和保存方麵要考慮以下幾個(ge) 方麵：1）要注意避免出現嚴(yan) 重溶血。血紅蛋白中含有血紅素基團，其有類似過氧化物的活性，故在以HRP為(wei) 標記酶的ELISA 測定中，如血清標本中血紅蛋白濃度較高，則很容易在溫育過程中吸附於(yu) 固相，從(cong) 而與(yu) 後麵加入的HRP底物反應顯色［1］。2）樣本的采集及血清分離中要注意避免細菌汙染。細菌生長分泌的一些酶可能會(hui) 對抗原抗體(ti) 等蛋白產(chan) 生分解作用；此外一些細菌的內(nei) 源性酶如大腸杆菌的β-半乳糖苷酶本身會(hui) 對用相應酶作標記的測定方法產(chan) 生非特異性幹擾。3）血清標本如是以無菌操作分離，則可在2～8℃下保存1周。如為(wei) 有菌操作，則建議冰凍保存。樣本的長時間保存應在- 70℃以下。4）冰凍保存的血清標本須注意避免因停電等造成的反複凍融。標本的反複凍融所產(chan) 生的機械剪切力將對標本中的蛋白等分子產(chan) 生破壞作用，從(cong) 而引起假陰性結果。此外凍融標本的混勻亦應注意，不要進行劇烈振蕩，反複顛倒混勻即可。5）標本在保存中如出現細菌汙染所致的混濁或絮狀物時，應離心沉澱後取上清檢測。對用於(yu) 激素和治療藥物測定的血清標本的收集，要注意收集時間對測定結果產(chan) 生影響。

實驗時通常將試劑從(cong) 冰箱中拿出來即用，而忽略了這種做法有可能影響後麵溫育時間不夠的問題，其直接的後果是對一些弱陽性標本的檢測出現假陰性。因此在ELISA測定中試劑準備zui關(guan) 鍵的是，在實驗開始前，將試劑盒先從(cong) 冰箱中拿出來，在室溫下放置20分鍾以上後，再進行測定。以使試劑盒在使用前與(yu) 室溫平衡。其目的是在後麵的溫育反應步驟中，使反應微孔內(nei) 的溫度能較快地達到所要求的高度，以滿足測定要求。其次，目前的商品ky体育在线登陆中的洗板液均需在實驗室使用時對所提供的濃縮液稀釋配製，因此稀釋時所用的蒸餾水或去離子水應保證質量。此外，當試劑盒以OPD為(wei) 底物時，則底物溶液應在反應顯色前臨(lin) 時配製。

    在現在的ELISA商品試劑盒中，血清樣本的加入幾乎是*的要使用微量加樣器加入樣本的步驟。使用微量加樣器加樣必須注意避免以下幾點：加樣太快，無法保證微量加樣的準確性和均一性。加在孔壁上部的非包被區，易導致非特異吸附。濺出會(hui) 對鄰近孔產(chan) 生汙染。出現氣泡則反應液界麵有差異。試劑的加入除了要注意滴加的角度外，滴加的速度也很重要。滴加太快易出現重複滴加或加在兩(liang) 孔之間的現象，這樣就會(hui) 在孔內(nei) 的非包被區出現非特異吸附，從(cong) 而引起非特異顯色。故有時一份標本用相同的試劑盒兩(liang) 次測定結果不同，往往是上述加樣及試劑的錯誤所致。

       溫育是ELISA測定中zui容易出現問題的步驟。ELISA作為(wei) 一種固相免疫測定，必須在一定的溫度條件下反應一定的時間，且溫育所需時間與(yu) 溫度成負相關(guan) 性。zui為(wei) 常用的溫育溫度有37℃和室溫，其次是43℃和2～8℃。 目前ELISA商品試劑盒，國產(chan) 反應溫育時間為(wei) 37℃ 30分鍾～1小時，進口試劑盒為(wei) 37℃ 1～2小時才能較*的結合。溫育實際測定操作中要注意以下幾點：1）要保證在設定的溫度下有足夠的反應時間。在研究實驗室中，通有將微孔板一放入溫箱即開始計時，造成實際測定中溫育時間不夠，弱陽性樣本測不出來 。南方冬季室內(nei) 溫度較低應特別注意，此時微孔板轉入溫箱後37℃溫育時間不夠，以致弱陽性樣本測定為(wei) 陰性［3］。為(wei) 保證37℃下足夠的溫育時間，可自行確定本實驗室不同季節（不同室溫下）微孔板從(cong) 室溫拿至溫箱所需時間孔內(nei) 溫度才能達到37℃，用一小溫度計放置板孔反應溶液中測量觀察即可。2）溫育溫度的選擇。在有的ky体育在线登陆的說明書(shu) 中，指出溫育溫度可有兩(liang) 種。從(cong) 免疫測定的抗原抗體(ti) 反應的本質來看，在較低的溫度下反應較長的時間zui為(wei) *。建議在研究ELISA測定中盡量使用較低溫育溫度較長反應時間的條件。3）“邊緣效應”的排除。“邊緣效應”指外周孔顯色較中心孔深，原因為(wei) 96孔板周孔與(yu) 中心孔表麵熱力學梯度不同。使用水浴或在將反應溶液加入至板孔中時，將板和溶液均加熱至溫育溫度（如37℃），就可排除“邊緣效應”，且可提高測定重複性。
    總而言之，盡量采用水浴，溫育中讓微孔板浮於(yu) 水麵上，或將浸透水的沙布放入一大飯盒中成一濕盒，放於(yu) 溫箱中。這樣因板條孔底部直接與(yu) 37℃水或濕布的接觸，水浴箱或濕盒內(nei) 的高溫度使反應溶液的溫度迅速與(yu) 溫室平衡。