關於ky体育在线登陆方法測大鼠金屬硫蛋白應用

    ELISA以其快速、準確、安全、簡便的特點而成為(wei) 定量測定生物體(ti) 內(nei) 微量有機物的理想方法.為(wei) 了建立一套快速、有效、方便並能定量測定大鼠組織中MT含量的ELISA法,為(wei) 動物科學中的研究和應用提供MT的定量測定技術.

     1.大鼠MT抗小鼠抗血清的製備:用戊二醛法將純品Zn-MT與(yu) 載體(ti) 蛋白(BSA)偶聯後,作為(wei) 人工抗原,對大鼠皮下注射.免疫時抗原中MT量分別為(wei) 6ug/隻、12ug/隻、24ug/隻、48ug/隻、96ug/隻;加強免疫時所用抗原量依次加倍.前3次免疫時采用的是弗氏*佐劑乳化,後3次免疫采用弗氏不*佐劑乳化. 兩(liang) 批大鼠加強免疫的時間隔分別為(wei) 12日和16日.用免疫雙擴散方法測定抗血清效價(jia) .得出以下結論:當免疫抗原中MT的量為(wei) 12-24ug/隻,每次加強免疫時抗原量加倍,加強免疫間隔時間為(wei) 10日時,其免疫效果較佳,可使大部分大鼠抗血清效價(jia) 達到1:16以上.2.抗體(ti) 的純化及鑒定:將效價(jia) 達到1:16以上的MT大鼠抗血清用飽和硫酸銨鹽析法濃縮出γ-球蛋白,然後用DEAE-Sephadex A50層析柱分離提純IgG.實驗中發現洗脫液pH值為(wei) 7.4時洗脫*峰即為(wei) 純化的IgG,用不連續緩衝(chong) 係統聚丙烯酰胺凝膠濃度梯度電泳鑒定層析洗脫下的IgG達到電泳純.對純化後的IgG進行辣根過氧化物酶標記,用直接ELISA鑒定其為(wei) MT的特異性抗體(ti) .3.ELISA的建立:運用固相抗原間接非競爭(zheng) 型ELISA和固相抗原間接競爭(zheng) 型ELISA檢測豬體(ti) 組織中部分樣品MT的含量,結果表明:用間接非競爭(zheng) 型ELISA測定樣品時其結果不夠穩定,同一樣品所對應的0D值相差較大,此方法僅(jin) 適合於(yu) 樣品中MT定性檢測;采用間接競爭(zheng) 型ELISA測定樣品,OD值比較穩定.用方陣滴定法確定了間接競爭(zheng) 型ELISA的各項具體(ti) 條件:抗原*包被濃度為(wei) 6.25ug/ml,一抗(小鼠抗大鼠)使用適宜濃度為(wei) 50ug/ml,酶標抗體(ti) (山羊抗大鼠)的使用濃度為(wei) 1/8000倍,反應時間為(wei) 3hr.用標準MT,采用間接競爭(zheng) 型ELISA方法擬合的標準曲線回歸方程為(wei) :y=105×2(22.32880-0.39583x),相關(guan) 係數為(wei) :R=0.9592.該方法的靈敏度為(wei) 4.1ng/ml,批間和批內(nei) 變異係數為(wei) 9.9760％-14.3858％,在實際應用中有較好的穩定性.

說明該試驗建立的間接競爭(zheng) 型ELISA具有特異性強、靈敏度較高、穩定性和重複性好、適合於(yu) 大批量樣品的檢測等優(you) 點,不失為(wei) 對MT進行定量分析的一種有效方法.