上海信帆生物：TUNEL檢測選擇指南

細胞凋亡一直都是細胞生物學研究的熱點，這個(ge) 複雜的過程涉及多條通路，可以用多種方法在不同的階段進行檢測。細胞凋亡晚期，細胞核發生形態變化、染色質凝聚、核膜降解、DNA片段化。
TUNEL（脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）介導的缺口末端標記法）是檢測DNA片段化的成熟方法，自1992年發表以來經過不斷改進，縱橫實驗室逾20年，至今仍然是廣泛采用的凋亡檢測方法，這是因為(wei) TUNEL能夠與(yu) 其他細胞學技術很好的契合。比如，使用TUNEL分析進行凋亡研究有一個(ge) 好處，研究人員在TUNEL法標記細胞之後，在直接檢測和定位凋亡信號的同時，還可以通過抗體(ti) 在同一個(ge) 樣本上檢測細胞表麵和細胞內(nei) 的生物學指標。
TUNEL的基本原理：DNA斷裂時會(hui) 產(chan) 生大量的粘性3'-OH末端，在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）的作用下，將生物素或熒光素或digaoxin標記的dUTP摻入到DNA的3'-末端，可通過一定的顯色係統使之顯示出來。過去，TUNEL算得上是個(ge) 值得“用心摸索”的試劑盒，因為(wei) 有點技術難度。如今市場上的TUNEL檢測產(chan) 品有了哪些改進和新選擇呢？ 
考慮通透性和標記
TUNEL檢測的一個(ge) 關(guan) 鍵要素是把握好細胞透化的時間。透化的目的是通透細胞膜和核膜，通俗說就是在膜上打孔，讓反應試劑得以充分進入細胞核進行反應，提高檢測效果。門開小了大家俬不好進場，若透化不足可能檢測不到凋亡的特征，造成假陰性。可開孔太過又影響形態，透化時間太長還容易脫片。 
DNA的標記是另一個(ge) 重要的影響因素。標記分子太大則不利於(yu) TdT將其摻入DNA片段。早期的分析中dUTP通常用生物素或熒光素標記，由於(yu) 熒光基團的“大塊頭”，使得其標記的dUTP摻入DNA的效率要低於(yu) 預期。後來改進為(wei) 利用Br-dUTP來取代生物素或熒光素標記的dUTP，因為(wei) 溴分子比熒光素、生物素等標記物要小得多，因此Br-dUTP更容易被摻入凋亡細胞的DNA片段中，再經過Br-dUTP抗體(ti) 識別、以及抗體(ti) 上偶聯的生物素或熒光素放大或顯色，使得zui後的檢測信號也更強。但是，Br-dUTP要用抗體(ti) 檢測，要求嚴(yan) 謹的反應條件。
更好的選擇是EdUTP，這種以炔烴基團（一種小分子基團）修飾的dUTP比Br-dUTP更小，更容易被TdT摻入到DNA末端。更妙的是，EdUTP的檢測不需要經過抗體(ti) ，而是通過一步高度特異性的click反應（一種銅催化的疊氮化物與(yu) 炔烴之間的反應），將摻入DNA的EdUTP上的炔烴基團，與(yu) 疊氮化合物（偶聯生物素或熒光素）共價(jia) 連接，再借助疊氮化物上的生物素或熒光標記，可實現靈敏的TUNEL檢測。與(yu) BrdU抗體(ti) （分子量約為(wei) 150 kDa）相比，這個(ge) 疊氮化物的大小僅(jin) 為(wei) 1%（分子量<~1000 Da），通透性要好得多。 
click技術的優(you) 勢在於(yu) 疊氮化物和炔烴都是極小的惰性基團，因此，隻需要溫和的固定和透化條件，即可達到讓試劑充分滲透進入細胞核。同時，高度特異的click反應可實現更低的背景幹擾，和更穩定的共價(jia) 結合產(chan) 物，從(cong) 而更好地檢測凋亡細胞。此外，升級版的Click-iT Plus技術無需銅的參與(yu) ，染料兼容性更廣泛，在多色檢測中表現更出色。

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