上海信帆生物：人抑瘤素M與小鼠LIF

在轉基因和敲除研究中，維持多能性對利用小鼠胚胎幹(ES)細胞至關(guan) 重要。已經發現許多因子可以影響ES細胞的多能性,其中之一就表現在白血病抑製因子（LIF）對ES細胞培養(yang) 的影響。關(guan) 於(yu) 抑瘤素M（OSM）能補償(chang) LIF在ES細胞培養(yang) 中的作用，對此存在不一致的報道。一些研究提示在維持ES細胞多能性方麵，OSM不如LIF有效。然而，其他研究發現它們(men) 是等效的。在本研究中，我們(men) 證明在維持ES細胞多能性上，人OSM擁有與(yu) 小鼠LIF相類似的功效，包括長期（超過10天）維持多能性、體(ti) 外分化的能力、活化STAT3的能力和種係傳(chuan) 遞能力。我們(men) 的研究提示OSM可能是在早期胚胎發育中發揮作用的另一種因子，並且在小鼠ES細胞培養(yang) 時，OSM可以被用作LIF的替代物。

抑瘤素M維持未分化ES細胞的形態

圖1：LIF或OSM中長期培養(yang) 後的細胞形態比較。（圖A，C），細胞培養(yang) 於(yu) 103 U/mL的LIF中。（圖B，D），細胞培養(yang) 於(yu) 10 ng/mL的OSM中。圖A和圖B是生長於(yu) 輻射照過MEF細胞上的細胞，圖C和圖D是生長於(yu) 明膠包被平板上的細胞。

圖像攝於(yu) 第6代，然而，細胞在OSM培養(yang) 基中可以連續25代維持未分化形態。箭頭所指是具有未分化形態的ES細胞克隆。所有圖片在200倍鏡下拍攝。

材料和方法

細胞培養(yang) ：CJ7 ES細胞係由Tom Gridley贈予。高葡萄糖DMEM培養(yang) 基另加15%胎牛血清（FBS），4 mM穀氨酰胺，10 μM ，1% MEM非必需氨基酸，每毫升50 IU青黴素，每毫升50 μg鏈黴素，和每毫升103 U的LIF （ESGRO；Chemicon，Temecula CA）或者10 ng/mL的抑瘤素M（R&D Systems，目錄#295-OM），以此培養(yang) ES細胞。細胞生長於(yu) 輻射照過的小鼠胚胎滋養(yang) 細胞（MEFs）上或者0.1%明膠包被的平板上。細胞每兩(liang) 天傳(chuan) 代一次。

把106個(ge) 細胞傳(chuan) 到含有10%FBS，每毫升50 IU青黴素，每毫升50 μg鏈黴素，4 mM穀氨酰胺和DMEM培養(yang) 基的6孔組織培養(yang) 皿中，以此製備類胚體(ti) （EBs）。用培養(yang) 基衝(chong) 洗培養(yang) 皿，分離細胞團。把細胞團轉移至有蓋培
養(yang) 皿，然後每天更換培養(yang) 基。要進行分化時，懸浮培養(yang) EBs 4至6天，然後轉移0.1%明膠包被的24孔板，讓細胞貼板生長7天，再進行免疫細胞化學實驗或為(wei) RT-PCR提取RNA。

RT-PCR：用RNAeasy試劑盒（Qiagen），根據產(chan) 品說明書(shu) 從(cong) 未分化的ES細胞和分化的EBs中提取RNA。使用Superscript First-Strand Synthesis System（Invitrogen），根據產(chan) 品說明書(shu) ，500 ng RNA通過隨機六聚體(ti) 引物進行逆轉錄。2 μL cDNA用作擴增模板。所有引物在55℃下退火，擴增35個(ge) 循環。

免疫細胞化學：所用一抗（rtxh/mOct3/4；mxh/mSox2；gtxmNanog；mxβIIITubulin；mxhTroponinT和gtxhHNF3β）購於(yu) R&D Systems。細胞或EBs轉養(yang) 到24孔板中的蓋玻片上。在室溫下用4%多聚甲醛固定細胞20分鍾，然後將細胞在含有1%BSA（PBA）的PBS中洗4次。用含有PBA溶解的0.1%Triton X-100的10%驢血清封閉細胞45分鍾。然後加入10 μg/mL的一抗，孵育3個(ge) 小時，之後把細胞在PBA中清洗三次，每次洗5分鍾。然後，用5 μg/mL的NothernLightsTM557連接的二抗（R&D Systems）孵育細胞1個(ge) 小時，然後如上清洗細胞。

STAT3活化水平：用Active STAT3 DuoSet IC試劑盒（R&D Systems）檢測STAT3的活化水平。根據試劑盒說明書(shu) ，用生長於(yu) 或未生長於(yu) MEFs上的未分化ES細胞製備細胞核提取物。用Bradford檢測對蛋白質進行定量分析。STAT3活化水平根據產(chan) 品說明書(shu) 而確定，然後根據總蛋白水平進行標準化處理。

小鼠嵌合體(ti) 的生物試劑：所有程序由密西根大學動物使用和照顧委員會(hui) 批準。根據國家研究委員會(hui) 關(guan) 於(yu) 實驗動物照顧和使用指南概述的原則和程序對動物提供照顧。在含有LIF或者OSM的培養(yang) 基中連續傳(chuan) 代5次後，用胰蛋白酶處理細胞，然後將16個(ge) ES細胞顯微注射到囊胚中。囊胚取自與(yu) C57BL/6J X DBA/2J/F1雄小鼠（The Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME）交配的超數排卵的C57BL/6NCrl雌小鼠（Charles River Laboratories，Wilmington，MA）。注射當天，用標準方法把顯微注射的囊胚轉移到假孕的受體(ti) 雌鼠體(ti) 內(nei) 。用嵌合體(ti) 與(yu) C57BI/6J雌鼠交配來檢測種係傳(chuan) 遞。

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