上海信帆生物：從互作揭開lncRNA的秘密

RNA結合蛋白免疫沉澱技術又稱為(wei) RIP（RNA immunoprecipitation），可以說是RNA版的ChIP（染色質免疫沉澱），該技術能幫助人們(men) 分析與(yu) RNA結合蛋白相關(guan) 的核酸。

在RIP試劑盒（如Sigma的Imprint® RNA Immunoprecipitation kit）的幫助下，研究者們(men) 能夠利用針對RNA結合蛋白的抗體(ti) ，從(cong) 細胞提取物中捕獲與(yu) 蛋白相結合的RNA，再通過qPCR、芯片或二代測序技術對這些RNA進行鑒定。

不論是細胞質還是細胞核，都會(hui) 發生RNA與(yu) 蛋白的相互作用。據Active Motif公司產(chan) 品Kyle Hondorp介紹，該公司的RNA ChIP-IT® kit於(yu) 研究RNA與(yu) 細胞核染色質的相互作用。該試劑盒通過甲醛固定來鎖定RNA-染色質的互作，隨後對染色質進行超聲，並用DNAse I處理，zui後利用磁珠進行沉澱。

“如你研究的是總mRNA，那麽(me) 常規RIP試劑盒更合適一些，”Hondorp說，“常規RIP試劑盒可以處理所有細胞裂解物的總mRNA。”

生物試劑Magna RIP™ RNA-binding protein immunoprecipitation kit的EMD Millipore公司，也在開發專(zhuan) 門針對染色質的RIP試劑盒。預計這一新產(chan) 品將於(yu) 2014年*季度發布，該產(chan) 品有化學交聯與(yu) native兩(liang) 種形式。據介紹，化學交聯可以分析究間接的蛋白-RNA相互作用，研究更高分子量的蛋白複合物。而native方法展現的是，親(qin) 和力更高也更為(wei) 直接的相互作用。

除RIP以外，CLIP（UV crosslinking and immunoprecipitation）也可以幫助人們(men) 捕捉與(yu) RNA結合蛋白互作的核酸。CLIP方案整合了交聯與(yu) 核酸酶消化，不僅(jin) 允許對RNA-蛋白複合物進行進一步的純化（如凝膠電泳片段分離），還能夠揭示RNA-蛋白互作所發生的位點。zui近人們(men) 又開發出了新型CLIP 技術——iCLIP（individual-nucleotide resolution CLIP），該技術能夠以單個(ge) 堿基的分辨率，來展示RNA-蛋白互作的詳細信息。

據倫(lun) 敦大學學院的Jernej Ule教授介紹，CLIP與(yu) RIP的關(guan) 鍵性差異，在於(yu) 沉澱複合物後的凝膠純化步驟。CLIP技術可以給RNA-蛋白複合物的RNA末端帶上放射性標記，並將這些複合物進行SDS-PAGE分離，之後轉移到一張膜上。這樣的過程可以提高純化的特異性，減少非特異性的RNA。蛋白酶消化可以將RNA從(cong) 膜上解離下來，用於(yu) 製備cDNA文庫，以備測序分析。

“CLIP要比RIP麻煩一些，不過我認為(wei) 它很值得采用，”Ule說。“放射性信號的量及其特異性，能夠幫助我們(men) 提高cDNA文庫的質量，zui終得到準確實用的數據。”

ChIRP、CHART和RAP

如果你對某種RNA感興(xing) 趣，希望研究與(yu) 其發生相互作用的蛋白，就需要采用新的實驗方案。ChIRP（chromatin isolation by RNA purification）、CHART（capture hybridization analysis of RNA targets）和RAP（RNA antisense purification）都基於(yu) 同樣的理念，將與(yu) 目標RNA互補的寡核苷酸進行生物素標記，並由此捕獲相關(guan) 蛋白。之後研究者可以通過二代測序或質譜分析，來鑒定與(yu) RNA互作的蛋白，明確發生這些互作的基因組區域。

據NEB的G. Brett Robb介紹，上述三種方法解決(jue) 了當今RNA生物學中的關(guan) 鍵需求。目前，研究者們(men) 已經鑒定了大量的lncRNA，但卻不清楚它們(men) 的功能。“解決(jue) 這一問題的途徑之一，就是尋找與(yu) 這些RNA發生互作的蛋白。”舉(ju) 例來說，加州理工學院的Mitchell Guttman和賓州大學的Jeannie Lee，就分別在使用RAP和CHART對Xist lncRNA展開研究。

據悉，目前ChIRP、CHART和RAP技術都還沒有商業(ye) 化。不過有一個(ge) 試劑盒可以實現從(cong) 已知RNA分離蛋白，即MBL International的RiboTrap係統，該係統能夠利用體(ti) 外轉錄的RNA（帶生物素標記），從(cong) 細胞提取物中分離與(yu) 之結合的蛋白。

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