上海信帆生物：怎樣解決RNAi的脫靶問題

生物通報道：在使用殺傷(shang) 性武器的時候，不傷(shang) 及無辜很重要，對於(yu) RNA幹涉（RNAi）來說也是如此。RNAi是一種常用的基因失活工具，它的主要缺陷在於(yu) 會(hui) 引起序列特異性的脫靶效應。這樣的脫靶效應很難預測，因為(wei) siRNA能夠影響與(yu) 它部分互補的序列，像miRNA那樣抑製基因的表達。

要減少脫靶效應，可以將針對同一mRNA的不同siRNA混合起來使用。這些siRNA作用於(yu) 同一個(ge) 目標，每種siRNA的濃度得以降低，稀釋了各自的脫靶效應。然而，這一策略在實際操作中麵臨(lin) 著兩(liang) 個(ge) 問題。其一，目前“Smart pools”隻包括四個(ge) 合成的siRNA，複雜性還不足以顯著減少脫靶效應，而合成更多siRNA的成本又太高。其二，利用Dicer或RNase III消化dsRNA時，siRNA混合物中會(hui) 出現長度各異的剪切產(chan) 物，進而引發許多問題。

日前，Regensburg大學的Gunter Meister領導研究團隊在Nucleic Acids Research雜誌上發表文章，描述了一種能克服上述問題的新方法。這種被稱為(wei) siPools的低成本方法，能夠簡單而的生成含有多達60種siRNA的混合物，將脫靶效應降低到檢出限以下。

據介紹，siPools的關(guan) 鍵一步是，設計針對同一個(ge) 基因的幾十種siRNA，並將這些序列結合到一個(ge) DNA模板上，不同siRNA序列之間以短序列相連。這些模板經過轉錄、退火和酶切就能生成成分明確的siRNA混合物。

為(wei) 了驗證siPools的效果，研究人員選擇人類基因POLG和SCYL1作為(wei) RNAi的靶標。之前有研究顯示，針對這兩(liang) 個(ge) 基因的siRNA很容易影響到MAD2基因的表達，因此它們(men) 可以作為(wei) 檢測脫靶效應的理想對象。

研究人員針對這兩(liang) 個(ge) 基因，分別設計了含有60個(ge) siRNA的siPools，然後用它們(men) 轉染HeLa細胞。研究顯示，在濃度相同的情況下，siPools敲低目標基因與(yu) 單個(ge) siRNA一樣有效。

這兩(liang) 個(ge) siPools都含有一個(ge) MAD2脫靶效應很強的siRNA。然而在轉染之後，MAD2上並未發生可檢測到的脫靶影響。研究人員隨後又通過螢光素酶報告基因證實了這一點。

此外，研究人員還進行了全轉錄組的芯片分析。他們(men) 發現，單個(ge) 脫靶siRNA除了MAD2以外還大大減少了許多其他的轉錄本，但siPools對MAD2和總體(ti) 轉錄本水平都沒有影響。這說明，將大量siRNA混合起來的確能夠大大降低RNAi的脫靶效應。下一步，Meister將進一步評估siPools在活體(ti) 內(nei) 作用效果。

值得注意的是，Meister等人還將siPools成功用於(yu) 長非編碼RNA（lncRNA）。單個(ge) siRNA往往難以對lncRNA施加影響，這可能是因為(wei) 單個(ge) siRNA難以接觸到高度結構性的lncRNA分子。現在，研究團隊正在構建針對lncRNA的siPool文庫。

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