上海信帆生物：讓基因組測序繞過PCR擴增

在基因組測序中，PCR擴增似乎是繞不過去的一步。然而，PCR也帶來一些問題，包括不均勻擴增，導致某些序列的比例過高。對目前的新一代測序（NGS）平台而言，測序某些堿基組成上存在嚴(yan) 重偏向的基因組區域仍是一大挑戰。在GEN雜誌上，Patricia Fitzpatrick Dimond博士介紹了PCR-Free的基因組測序。

文庫製備的變革

2009年，Sanger研究院的Iwanka Kozarewa博士及其同事介紹了一種無需擴增的Illumina文庫製備方法（Nature Methods 2009;6:291–295）。他們(men) 表示，GC偏向的基因組的定位和組裝有所改善。這種方法采用簇擴增步驟來富集*連接的模板鏈，降低了重複序列的發生率，改善了序列定位和SNP檢出。

這種方法的核心是采用no-PCR接頭，它們(men) 包含額外的序列，讓模板能夠與(yu) 流動槽表麵直接雜交，這樣就不再需要PCR步驟。作者表示，通過此方法產(chan) 生的DNA模板量低於(yu) PCR方法，但定量研究表明，從(cong) 5 μg起始DNA中獲得的文庫足夠400個(ge) GA通道的測序，這滿足了大多數的實驗需求。此外，由於(yu) 省去了PCR步驟，這種方法比標準的文庫製備更快。

Illumina的產(chan) 品Rooz Golshani表示：“我們(men) 的PCR-free產(chan) 品，TruSeq® DNA PCR-Free Library Preparation Kit，是金標準，也是產(chan) 生zui完整基因組的*方案。”Golshani博士指出，研究人員在需要避免PCR相關(guan) 的偏向時，往往采用此試劑盒來製備文庫。

2015年，J. Craig Venter研究所的Marcus B. Jones及其同事指出，隨著全基因組測序被廣泛用於(yu) 人類微生物組研究，研究結果往往被證明是衝(chong) 突或不確定的（Proc Natl Acad Sci USA 2015;10;112:14024-9）。

研究人員開展定量和定性分析來比較WGS宏基因組數據。他們(men) 采用Illumina Nextera XT和TruSeq DNA PCR-Free以及KAPA Biosesystems的Hyper Prep PCR和PCR-Free係統。研究表明，這四種不同的NGS文庫製備導致分類出現明顯差異。根據分析的結果，他們(men) 建議從(cong) 事微生物組研究的研究人員采用PCR-free的方法來減少PCR偏向，從(cong) 而獲得更準確的分類信息。

納米孔測序

這些PCR-free的技術都是針對Illumina的測序儀(yi) 開發的，不過，一種顛覆性的測序技術已經*改變DNA測序的方式，這就是納米孔測序。

Oxford Nanopore Technologies開發的手機大小的MinION測序儀(yi) 有望zui終拋棄PCR。它讀取長的DNA片段，不過目前仍需要文庫製備。這種方法在分辨重複序列或單體(ti) 型上具有優(you) 勢，因為(wei) 單個(ge) 測序片段就能跨越含糊不清的區域。未來，這種設備有望用於(yu) 實時醫療診斷和法醫檢驗。

不過，英國研究人員認為(wei) ，在廣泛采用MinION之前，需要評估其通量和準確性（Biomol Detect Quantif 2015;3: 1–8）。他們(men) 利用MinION對三個(ge) 細菌基因組進行重測序，這些有著不同的核苷酸組成。研究人員發現，MinION堿基檢出後的錯誤率為(wei) 38.2%。讀長平均值和中值分別為(wei) 2 kb和1 kb，而zui長的序列達到98 kb。作者認為(wei) ，盡管錯誤率限製了MinION的競爭(zheng) 能力，但是與(yu) Illumina MiSeq的數據相結合，MinION的序列數據可增強de novo組裝。

隨著MinION的試用報告不斷出爐，人們(men) 發現，MinION本身也能做很多事情。它能可靠地測序小型基因組，如細菌和酵母。它也能區分親(qin) 緣關(guan) 係很近的細菌和病毒，讀取人類基因組中的複雜區域，並區分一對染色體(ti) 上的兩(liang) 個(ge) 基因版本。此外，傳(chuan) 染病檢測也有望成為(wei) 這種手持式測序儀(yi) 的一大應用。

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