上海信帆生物：溶血空斑形成試驗

溶血空斑形成試驗是一種體(ti) 外檢測單個(ge) 抗體(ti) 形成細胞(漿細胞)的方法，故又稱體(ti) 外抗體(ti) 形成細胞(Plaque Forming Cell, PFC)測定技術。此項技術不僅(jin) 可以作為(wei) 免疫基本理論研究的有力工具，廣泛地用於(yu) 檢測產(chan) 生IgM類型(包括其它各類免疫球蛋白及其亞(ya) 類)的抗體(ti) 形成細胞，它還可作為(wei) 研究篩選抗腫瘤新藥以及研究中藥對抗體(ti) 免疫功能影響的免疫學指標。 
一、原理： 
　　溶血空斑形成試驗的基本原理是將經綿羊紅細胞免疫小鼠的脾細胞與(yu) 一定量的綿羊紅細胞混合，在補體(ti) 參與(yu) 下，使抗體(ti) 形成細胞周圍那些受到抗體(ti) 分子致敏的綿羊紅細胞溶解，形成肉眼可見的溶血空斑。根據所操作的方法不同可分為(wei) 直接溶血空斑試驗，間接溶血空斑試驗，瓊脂固相法，小室液相法，單細胞層法等等。下麵介紹直接溶血空斑形成試驗。 
　　二、操作步驟： 
　　1. 底層瓊脂平皿的製備：將1.4％瓊脂加熱融化後傾(qing) 注於(yu) 平皿內(nei) ，每個(ge) 平皿6ml，凝固後置濕盒37℃備用。 
2. 0.7％瓊脂加熱融化後加入華氏管內(nei) ，每管2ml，47～49℃水浴保溫備用。 
　　3. 免疫小鼠脾細胞懸液製備：用4×10３ 個(ge) 綿羊紅細胞(SRBC)鹽水懸液腹腔免疫小鼠，對照為(wei) 等量生理鹽水。4天後，小鼠拉脫頸椎處死，取出脾髒，用RPMI164。洗一次後置平皿中不鏽鋼篩網上,用注射器針芯研磨成懸液,洗滌兩(liang) 次,調整細胞數為(wei) 3～8×10６/ml。台盼蘭(lan) 染色查活細胞數應大於(yu) 90％。置4℃冰箱備用。 
　　4. 試驗平皿的製備：依次將預溫40℃左右的25％SRBC、牼-SRBC吸收的滅活胎牛血清以及保存於(yu) 4℃的脾細胞懸液各0.1ml加入預熱47～49℃的含0.7％瓊脂的華氏管中，迅速混勻，立即傾(qing) 注於(yu) 鋪有底層瓊脂的平皿內(nei) ，凝固後，置37℃孵育1小時。 
5. 加入1∶5～1∶10稀釋的新鮮豚鼠血清0.5～1.0ml，使其均勻覆蓋表麵,再次置37℃溫育30分鍾，即可用肉眼或借助於(yu) 放大鏡進行空斑計數。 
　　三、試劑和器材 
　　㈠ 試劑 
　　1. 1.4％瓊脂：用pH7.4PBS配製。 
　　2. 0.7％瓊脂：用pH7.4PBS配製 
3. 25％SRBC鹽水懸液 
4. RPMI1640 
5. 胎牛血清，56℃30分鍾滅活，並經SRBC吸收 
　　6. 補體(ti) ：新鮮豚鼠血清，用前經SRBC吸收後，用RPMI1640稀釋。 
　　㈡ 器材：玻璃平皿7×1.5cm，三角燒瓶，水浴箱(47～49℃)，華氏管，1ml注射器，不鏽鋼篩網，青黴素瓶，離心管，不同規格加樣器等。 
四、注意事項： 
　　1. 0.7％瓊脂必須置47～49℃水浴融態保溫。如溫度過高會(hui) 導致SRBC溶血或所加入脾細胞的死亡。溫度過低則在操作過程中瓊脂發生凝固，影響上層瓊脂平板的製備 
2. 離體(ti) 的脾細胞應置4℃冰箱保存，防止抗體(ti) 分泌和細胞死亡。 
　　3. 在製備試驗平皿時，對於(yu) 所有玻璃器皿和各種試劑，均需預溫，牭1各種試劑加入華氏管後，應與(yu) 0.7％瓊脂迅速充分混勻，然後立即傾(qing) 倒於(yu) 底層瓊脂上，並避免傾(qing) 入氣泡。 
　　4. 加入的補體(ti) 應均勻覆蓋於(yu) 表層瓊脂上。 
　　5. 製備底層平皿和試驗平皿時，均須將平皿置於(yu) 水平台上，以保證瓊脂麵鋪平。

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