上海信帆生物：酶聯免疫吸附檢測法

一、原理

植物激素（planthormone）免疫定量主要有放射免疫分析（RIA）和酶聯吸附免疫分析（ELISA），由於(yu) 前者操作上欠安全等原因，目前常采用後一種類型。在ELISA中，抗原抗體(ti) 反應的檢測依靠酶標記物來實現，常用的酶有辣根過氧化物酶和堿性磷酸酯酶。酶可直接標記激素分子，稱為(wei) 酶標植物激素，也可標記於(yu) 第二抗體(ti) （識別抗激素抗體(ti) Fc片段的抗體(ti) 或金黃色葡萄球菌A蛋白），稱為(wei) 酶標二抗。這兩(liang) 類標記物分別用於(yu) 固相抗體(ti) 型和固相抗原型ELISA。A.固相抗體(ti) 型ELISA：將抗激素的單克隆抗體(ti) （Mab）與(yu) 已吸附於(yu) 固相載體(ti) 上的兔抗鼠Ig抗體(ti) （RAMIG）結合，然後加入激素標準品或待測樣品，使其與(yu) 固相化的Mab結合， 再加入辣根過氧化物酶（HRP）標記激素（酶標激素）。通過測定酶標激素的被結合量，可換算出未知樣品中激素的數量。B.固相抗原型ELISA：將“激素-蛋白”複合物（該蛋白應不同於(yu) 免疫原中的載體(ti) 蛋白）包被於(yu) 固相載體(ti) ，加入待測激素（樣品或標準品）和抗IAA多克隆抗體(ti) （Pab）反應，進行競爭(zheng) 反應。然後讓HRP標記羊抗兔Ig抗體(ti) （HRP-GARIG）與(yu) 結合在固相上的Pab反應，通過測定與(yu) 固相結合的酶量，換算出未知樣品中激素的含量。

二、材料、儀(yi) 器設備及試劑 

（一）材料：高等植物、真菌、藻類等組織或器官。

（二）儀(yi) 器設備：1. 酶聯免疫檢測儀(yi) ；2. 高速冷凍離心機；3. 恒溫箱；4. 連續進樣器；5. 渦旋儀(yi) ；6. 96孔微孔板；7. 離心管；8. 研缽或勻漿器；9. 試管。

（三）試劑1. 洗滌緩衝(chong) 液：0.01mol/L pH7.4磷酸緩衝(chong) 液（PBS），含0.05％Tween-0；2. RAMIG溶液，或“激素-蛋白”複合物；3. 0.1％封閉蛋白（該蛋白應不同於(yu) 免疫原中的載體(ti) 蛋白）；4. 抗激素Mab，或Pab；5. 激素標準品母液，及參比係列溶液（按雙倍或四倍係列稀釋）；6. HRP標記激素，或HRP-GARIG；7. 鄰苯二胺（OPD）基質液：5mgOPD溶於(yu) 12.5ml0.01mol/L pH5.0PBS，用前加入30％H2O212.5μl。

三、實驗步驟 

固相抗體(ti) 型elisa。
1. 用方陣法滴定選擇各反應物zui適工作濃度；
2. 將100μlRAMIG溶液包被聚苯乙烯反應板微孔，4℃濕盒，12h；
3. 棄去孔內(nei) 溶液，用洗滌緩衝(chong) 液洗滌3次，甩幹；
4. 加入100μl抗激素Mab溶液，37℃70min；